血清miR-501和miR-195检测对宫颈癌临床诊断及预后价值

胥琳琳 陈宗宁 崔蕾蕾 左月媛

江苏省盐城市第一人民医院 (224002)

宫颈癌是妇科常见恶性肿瘤[1]。MicroRNAs(miRNAs)是一类内源性小分子单链非编码RNA，能参与肿瘤的迅速分化、异样增殖、失控、浸润和转移等生物学性质的形成[2-3]。研究表明MiR-501和miR-195分别作为重要的促癌和抑癌miRNA，在多种肿瘤中发挥致癌和抑癌基因作用，可能是肿瘤诊断的良好靶点。因此，本研究通过检测宫颈癌患者血清中的miR-501和miR-195表达，分析其与宫颈癌关系，为探索宫颈癌发生机制和防止策略提供理论基础。

1 对象与方法

1.1 研究对象

回顾性收集2017年1月-2018年2月在本院确诊行手术治疗的宫颈癌患者61例临床资料为病例组，同期健康体检女性35例资料为对照组。入组标准：①术前未接受其他治疗；②无其他恶性肿瘤患病史；③未经过放化疗治疗；④组织病理类型的判断标准参照WHO宫颈癌病理学分类。本研究经医院医学伦理委员会批准，所有观察对象均签署知情同意书。

1.2 研究方法

1.2.1标本采集及保存采集空腹静脉血3ml，室温自然凝固10～20min，离心收集上清-80℃备用。

1.2.2RNA提取及质量控制按照TRIzol Reagent说明书标准操作提取总RNA，并通过紫外分光光度测定吸光度A(检测波长为260和280nm)，计算RNA含量和A260/A280比值，并利用A260/A280的比值定量检测血液内RNA的纯度和浓度(A260/280范围为1.8～2.0)， -80℃ 备用。

1.2.3荧光实时定量PCR法检测miR-501使用天根公司提供的试剂盒miRcute miRNA First- Strand cDNASynthesis Kit(KR201),实验所用miR-501上游单链为3'- AUCCUUUGUCCCUGGGUGAGA- 5'，试剂盒提供的通用引物作为下游单链，U6用作内参基因。使用美国Thermon Fisher Scientific研究机构PCR检测仪检测miR-501，所用试剂总量为20μl，其中cDNA2μl，2xmiRctue miRNAPremix(含SYBR，含ROX)10μl，miRNA 501引物(10 μmol/L)0.4μl，Reverse Primer(10μmol/L)0.4μl，50Xrox Reference Dye 1.6μl，ddhH2O 5.6μl。PCR反应条件为94℃15min预变性；94℃20s变性、60℃退火34s、70℃延伸30s、75℃收集荧光30s，共40个循环同时监测荧光信号。所有实验均进行阳性和阴性质量控制。miR-501血清表达量使用2-△△CT相对定量方法进行数据分析。

1.2.4荧光实时定量PCR法检测miR-195实验操作按照德国Qiagen公司的miScript SYBR Green PCP试剂盒(型号:218073)说明书操作。miR-195上游序列为5'-CCTAGCAGCACAGAAA-3'，试剂盒供应的通用引物作为下游单链。内参基因U6上游序列为5'-GTGCTCCCTGCTTCGGCAGCACATATAC-3'，下游序列为5'-AAAAATATGGAACGCTTCACGAATTTG-3'。本实验使用美国Thermon Fisher Scientific研究机构的实时荧光定量PCR检测仪，检测miR-195水平，所用总反应试剂量为20μl，其中包括ddhH2O 6 μl、SYBR Green PCR Master混合物10μl，cDNA 2μl(50ng)，miR-195引物量为上下游序列共1μl(1μmol/L)。PCR实验反应条件为:94℃预变性15min；94℃15s变性，60℃退火30s、70℃延伸25s、75℃收集荧光30s，共40个循环同时监测荧光信号。miR-195表达量使用2-△△CT相对定量方法进行数据分析。随访记录患者生存时间，统计6 miR-501和miR-195表达与患者生存关系。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 一般资料比较

病例组年龄(44.1±16.4)岁(23～76岁)；TNM分期为Ⅰ期15例、ⅡA期7例，ⅡB期21例，Ⅲ期18例；身体机能评估46.3±18.2分。对照组年龄(71.8±17.4)岁(25～75岁)，身体机能评估69.5±12.9分。两组比较无差异(P>0.05)。

2.2 两组miRNA表达差异

由实时荧光定量PCR，观察组miR-501血清中相对表达量(0.84±0.12)高于对照组(0.36±0.08)(t=21.103，P<0.001)， miR-195水平(0.97±0.23)低于对照组(0.38±0.11)(t=16.977，P<0.001)。

2.3 病例组miRNAs血清表达与临床特征

病例组61例中， miR-501高表达有41例(67.3%)、低表达20例(32.7%)；miR-195高表达有17例(27.8%)、低表达44例(72.2%)。miR-501及miR-195不同表达患者年龄、人乳头瘤病毒(HPV)感染、分化程度比较未见差异(P>0.05)；在TNM分期ⅡB期～Ⅲ期中，miR-501高表达占比高于低表达，而miR-195高表达占比低于低表达(P<0.05)；在淋巴结转移中，miR-501高表达者转移率高于低表达，而miR-195高表达者转移率低于低表达组(P<0.05)，见表1。

2.4 病例组miRNAs血清表达与生存时间关系

miR-501低表达患者生存时长(55.46±8.14月)高于高表达患者(27.27±5.16月)，miR-195高表达患者生存时长(59.39±9.60月)高于低表达患者(26.78±4.35月)(t=16.468、16.087，均P=0.000)。

表1 宫颈癌患者临床特征与miR-501、miR-195表达水平关系(例)

3 讨论

宫颈癌的发展通常与单核苷酸多态性变化、HPV感染、染色体突变等因素密不可分，是一种多因子、多步骤的复杂病变。随着基础病理研究的深化，宫颈癌的研究在分子生物学层面有了较大的进展。研究发现miRNAs在人类的众多肿瘤中表达出异常，扮演着促癌或抑癌角色。而宫颈癌的产生与MircroRNAs的表达水平有着密不可分的关联。对肾癌的研究发现，miR-501水平下降可激活其相应的下游P53通路，同时抑制PI3K/mTOR信号通路传导，导致肾癌细胞出现凋亡等病理状态[4]；在肝癌组织中miR-501含量上调，能抑制分子靶标基因CYLD的表达能力，提高其下游因子Cyclin D1和C-myc含量，导致肝癌发展、恶化[5]；肺癌患者体内MiR-501同样呈现出明显高表达[6]。文献检索发现，miR-195有可能参与调控肝癌衍生生长因子、KRAS、成纤维细胞生长因子8、MAPK3、细胞周期蛋白E1、细胞周期蛋白依赖性激酶4、基质金属蛋白酶3，从而参与肝癌的发展[7]。在结肠癌中，miR-195的失常调控可以加速肿瘤细胞生长因子以及肿瘤血管生成因子生成，同时侵袭MMP3因子，致使结肠癌细胞转移、病情恶化[8]。以上研究提示miR-501和miR-195分别在肿瘤中作为促癌基因和抑癌基因存在。

本研究结果显示，与对照组相比，宫颈癌患者外周血中miR-501和miR-195水平分别呈现出明显上调和下调现象，与Sanches等[9]研究结果一致，提示miR-501和miR-195的异常表达有助于宫颈癌的诊断。由于人体血清样本易于获得，且miRNAs较稳定存在于人体血清中，因此，检测外周血中miR-501和miR-195表达可辅助诊断和鉴别宫颈癌，具有一定临床应用价值。对临床病理资料数分析发现，宫颈癌患者血清中miR-501及miR-195表达与临床TNM分期、淋巴结转移有一定关系，但与患者的年龄、HPV感染、分化程度等未见差异；随访，miR-501高表达和miR-195低表达宫颈癌患者的平均存活时长明显缩短，表明miR-501高表达和miR-195低表达能影响宫颈癌患者预后。

综上所述，检测宫颈癌患者血清中miR-501和miR-195表达，有望成为宫颈癌诊断及评估预后的辅助性依据。但对于miR-501和miR-195在宫颈癌的形成和发展中的作用机制仍有待深入研究。