牡丹皮、赤芍配伍对活血化瘀疗效及有效成分的影响

张欢，何丽丽

（1.湖北省中西医结合医院 药学部，湖北 武汉 430015；2.武汉轻工大学食品科学与工程学院，湖北 武汉 430023）

牡丹皮、赤芍均为毛茛科植物，化学成分类似[1]。牡丹皮具有清热凉血、活血化瘀的功效，赤芍具有活血散瘀、止痛的功效，临床常相须为用，协同增效，为活血化瘀常用药对，如《金匮要略》中“温经汤”[2]、《外科正宗》之“活血散瘀汤”[3]、《备急千金要方》之“犀角地黄汤”[4]。但该药对配伍活血化瘀疗效及有效成分的变化研究少见报道。本文依据该药对的临床用药特点，以水煎汤剂为主要研究对象，考察两药配伍对家兔体外血小板聚集抑制率、体外凝血酶时间等活血化瘀药效指标的影响。同时，测定两药配伍后没食子酸、芍药苷、丹皮酚的含量变化。从生物效应及物质基础两方面研究该药对配伍的变化，初步探究其用药合理性，为临床用药提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药物与试剂 牡丹皮、赤芍（武汉天济饮片公司），经湖北中医药大学詹亚华教授鉴定分别为毛茛科植物牡丹（paeonia suffruticosa andr）的干燥根皮、毛茛科植物川赤芍（paeonia veitchii lynch）的干燥根。没食子酸、丹皮酚、芍药苷购自中国食品药品检定研究院，腺苷二磷酸（ADP）购自北京中勤世帝科学仪器公司，枸橼酸钠购自国药集团化学试剂公司，牛凝血酶购自美国Sigma 公司，乙腈、甲醇购自美国Teddia 公司。

1.1.2 仪器 Ultimate 3000高效液相色谱仪（美国Thermo Fisher 公司），BS124S 型电子天平（德国Sartorius 公司），KQ-250E 型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司），Milli-Q 超纯水机（美国Millipore公司），BE COMPACT X 全自动血凝检测仪（德国BE公司），DM0412 型离心机（北京大龙兴创实验仪器有限公司），移液器（德国Eppendorf 公司）。

1.1.3 动物 健康新西兰大耳白家兔，雄性，体重2.0 ～2.5 kg，由华中科技大学实验动物中心提供，许可证号：SCXK（鄂）2016-0009。

1.2 各组供试品溶液的制备

1.2.1 牡丹皮组供试品溶液的制备 称取牡丹皮20 g，加10 倍量的水，浸泡1 h，置于电炉上直火煎煮3 次，每次40 min。合并3 次滤液，过滤，浓缩至100 ml，0.45 μm 有机微孔滤膜滤过，即得0.2 g/ml 的牡丹皮浓缩液，临用时加水稀释至0.1 g/ml，即得0.1 g/ml的牡丹皮组供试品溶液。

1.2.2 赤芍组供试品溶液的制备 同牡丹皮组供试品溶液的制备方法，制备0.1 g/ml 的赤芍组供试品溶液。

1.2.3 牡丹皮、赤芍合煎组供试品溶液的制备 分别称取牡丹皮、赤芍各20 g，同按牡丹皮组供试品溶液的制备方法，制备0.2 g/ml 的牡丹皮、赤芍合煎组供试品溶液。

1.2.4 牡丹皮、赤芍单煎再混合组供试品溶液的制备 分别精密移取10 ml 的牡丹皮、赤芍浓缩液，混合均匀，浓缩后加水定容至10 ml，即为0.2 g/ml 的牡丹皮、赤芍单煎再混合组供试品溶液。

1.2.5 混合对照品溶液的配制 分别精密称取没食子酸、芍药苷、丹皮酚对照品0.00210、0.00184 和0.00163 g，于10 ml 容量瓶中，加甲醇定容，混匀，即得混合对照品溶液。其中没食子酸、芍药苷、丹皮酚的浓度分别为210、184 和163 μg/ml。

1.3 各组活血作用检测

1.3.1 对ADP 诱导家兔体外血小板聚集的影响 家兔颈总动脉取血4.5 ml，加至含有38 g/L 枸橼酸钠0.5 ml 的离心管中，混匀。另取肝素钠抗凝血5 ml。每次均采集6 个样本，室温下，将新鲜全血1 000 r/min离心10 min，取上层液，即为富血小板血浆（platelet rich plasma,PRP）；剩余部分以3 000 r/min 离心10 min，取上清液，即为贫血小板血浆（platelet poor plasma,PPP）。 采用血小板聚集仪进行血小板聚集功能测定，以纯净水为空白对照组，PPP 调零。测定时分别取各组供试品溶液100 μl 与150 μl PRP 在37℃比浊杯内孵育3 min，加搅拌珠，分别加入诱导剂ADP 10 μl 诱导血小板聚集，此时，牡丹皮组、赤芍组、合煎组、单煎再混合组的药液终浓度分别为40、40、80 及80 mg/ml，测试并记录6 min 内最大聚集率。

1.3.2 对血浆凝血酶时间的检测 测试杯通道中加入100 μl PPP 和各样品溶液80 μl，37℃温育3 min，再加入已预温的1.5×104u/L 凝血酶20 μl，混匀，此时，牡丹皮组、赤芍组、合煎组、单煎再混合组的药液终浓度分别为40、40、80 及80 mg/ml，用血小板聚集凝血因子分析仪测定凝血时间。对照组加100 μl 纯净水，每组重复6 次，取平均值，记录各组凝血时间。

1.4 各组化瘀作用检测

1.4.1 对血栓溶解的检测 取家兔枸橼酸钠抗凝血10 ml，然后依次加入200 μl 0.5%纤维蛋白原溶液、100 μl 50 g/L 氯化钙CaCl2溶液、200 μl 1.0×105u/L 凝血酶溶液。混匀，注入平底玻璃试管中，37℃水浴20 min 后取出血栓，切成0.5 cm 的小段，放入装有2 ml不同质量的药液中，对照组为2 ml 的纯净水，37℃温育，于0、6、12、24、48 h 分别测定剩余血栓段的质量，按照公式计算血栓溶解率：血栓溶解率=（血栓初始质量-药物作用后各时间点血栓质量）/血栓初始质量，各给药组平行测定6 次。

1.4.2 对全血凝块溶解的检测 家兔采血20 ml 置于表面皿中，2 h 后自然凝固后切成0.5 cm×0.5 cm× 0.5 cm 的小块，用生理盐水冲洗3 次，待用。将不同质量浓度的药液各2 ml 加入15 ml EP 管中，加纯净水至5 ml，对照组加5 ml 的纯净水，此时，牡丹皮组、赤芍组、合煎组、单煎再混合组的药液终浓度分别为40、40、80 及80 mg/ml，向各装有药液的EP 管中加入6 个血块，37℃温育，于0、6、12、24、48 h 分别测定血块的质量，按照公式计算全血凝块溶解率：全血凝块溶解率=（血凝块初始质量-药物作用后各时间点血凝块质量）/血凝块初始质量。

1.5 没食子酸、芍药苷、丹皮酚的含量测定

色谱条件：色谱柱：AcclaimTM120（250 mm× 4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B），梯度洗脱（1 ～6 min，10% A；6 ～20 min，10%～ 14% A；20 ～30 min，14%～35% A；30 ～40 min，35% A）；流速：1 ml/min；柱温：25℃；检测波长：230 nm；进样量：10 μl。

1.6 统计学方法

数据分析采用SPSS 13.0 统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组不同时间点的比较采用重复测量设计的方差分析，两两间比较用LSD-t检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 牡丹皮、赤芍配伍前后活血作用比较

2.1.1 对家兔体外血小板聚集的影响 空白对照组的血小板最大聚集率为42.62%，给予不同药液后，各组血小板最大聚集率均下降，差异有统计学意义（P＜0.05）。其中，牡丹皮组下降至24.84%，赤芍组下降至27.03%，合煎组的体外血小板聚集率为20.77%，单煎再混合组下降至23.45%。结果显示两药合煎能抑制家兔体外血小板聚集。见表1。

2.1.2 对血浆凝血酶时间的影响 空白对照组的家兔体外血浆凝血酶时间为13.45 s，加入各组药液后凝血酶时间均上升，差异有统计学意义（P＜0.05）。其中牡丹皮上升至17.32 s，赤芍组上升至18.94 s，合煎组上升最高，为21.01 s，单煎再混合组为19.87 s。结果显示两药合煎后，血浆凝血酶时间增加。见表1。

表1 家兔体外血小板最大聚集率和血浆凝血酶时间比较 （±s）

表1 家兔体外血小板最大聚集率和血浆凝血酶时间比较 （±s）

注：†与空白对照组比较，P ＜0.05

组别 浓度/ （mg/ml）血小板最大 聚集率/%血浆凝血酶 时间/s空白对照组 - 42.62±1.08 13.45±1.94牡丹皮组 40 24.84±2.16† 17.32±1.57†赤芍组 40 27.03±1.52† 18.94±3.51†合煎组 80 20.77±1.98† 21.01±1.68†单煎再混合组 80 23.45±2.11† 19.87±3.87†F 值 511.22 94.95 P 值 0.000 0.000

2.2 各组化瘀作用比较

2.2.1 对血栓溶解的影响 给药组与空白对照组在6、12、24、48 h 血栓溶解率的比较采用重复测量设计的方差分析，结果：①不同时间点的血栓溶解率有差异（F=1 344.74，P=0.000）；②各组血栓溶解率有差异（F=1 989.56，P=0.000）；③各组血栓溶解率变化趋势有差异（F=1 182.02，P=0.000）。各给药组均能促进体外血栓溶解，且与时间呈依赖性递增。48 h后，各给药组血栓溶解率几乎持平。见表2。

2.2.2 对全血凝块溶解的影响 各组在6、12、24、48 h 全血凝块溶解率的比较采用重复测量设计的方差分析，结果：①不同时间点的全血凝块溶解率有差异（F=1 254.15，P=0.000）；②各组血栓溶解率有差异（F=1 756.69，P=0.000）；③各组血栓溶解率变化趋势有差异（F=1 021.54，P=0.000）。各给药组均能促进家兔体外全血凝块溶解，且与时间呈依赖性递增。48 h 后，各组全血凝块溶解率几乎持平。见表3。

表2 各组体外血栓溶解率的比较 （±s）

表2 各组体外血栓溶解率的比较 （±s）

注：†与空白对照组比较，P ＜0.05

组别 浓度/（mg/ml）血栓溶解率/%6 h 12 h 24 h 48 h空白对照组 - 16.12±3.18 23.12±1.06 41.58±4.27 64.13±1.85牡丹皮组 40 18.43±2.14† 29.77±3.16† 51.99±1.64† 74.54±3.51†赤芍组 40 20.52±3.30† 31.43±2.65† 57.01±2.46† 75.03±2.63†合煎组 80 29.01±4.61† 45.76±3.66† 70.68±2.96† 76.11±3.26†单煎再混合组 80 27.65±2.11† 43.51±4.10† 65.87±4.31† 75.82±3.68†

表3 各组全血凝块溶解率的比较 （±s）

表3 各组全血凝块溶解率的比较 （±s）

注：†与空白对照组比较，P ＜0.05

组别 浓度/（mg/ml）全血凝块溶解率/%6 h 12 h 24 h 48 h空白对照组 - 11.11±2.75 19.76±2.10 34.13±2.09 60.12±3.58牡丹皮组 40 20.16±1.64† 31.27±1.33† 56.55±2.23† 76.29±2.35†赤芍组 40 21.44±2.56† 33.03±2.61† 57.26±3.15† 77.51±3.01†合煎组 80 27.01±3.01† 48.46±2.35† 72.08±3.29† 80.13±4.21†单煎再混合组 80 25.25±1.51† 44.98±3.66† 70.84±1.52† 78.62±3.27†

2.3 没食子酸、芍药苷、丹皮酚的含量

混合对照品及各供试品图谱见图1，以各色谱峰峰面积（Ŷ）对质量分数（X）进行线型回归，各成分的回归方程、相关系数及线型范围见表4。根据各成分的标准曲线计算各供试品中各成分的含量，每个样品重复测定3 次。两两比较采用LSD-t检验，结果表明，与牡丹皮组比较，赤芍组中没食子酸含量降低、芍药苷含量升高、丹皮酚含量升高（P＜0.05）。两者合煎后，与单煎再混合组比较，合煎组芍药苷含量增加（P＜0.05）、没食子酸含量几乎持平，差异无统计学意义（P＞0.05），说明两者配伍对没食子酸含量无明显影响；丹皮酚含量在各组中均在较低水平。见表5。

图1 混合对照品及各供试品溶液色谱图

表4 3 种成分的回归方程、相关系数及线型范围

表5 各组供试品溶液中3 种成分的含量 （±s）

表5 各组供试品溶液中3 种成分的含量 （±s）

注：1）与牡丹皮组比较，P ＜0.05；2）与单煎再混合组比较，P ＜0.05

组别质量分数/（mg·g）没食子酸 芍药苷 丹皮酚牡丹皮组 13.23±2.31 9.63±4.23 3.06±0.65赤芍组 6.44±2.6011） 49.70±2.331） 5.95±0.821）合煎组 20.48±1.08 62.54±1.882） 7.69±1.77单煎再混合组 19.06±0.52 53.27±3.15 7.03±2.93 F 值 121.23 146.32 35.76 P 值 0.041 0.046 0.053

3 讨论

中医认为血瘀是因血液瘀滞所带来的病症，凡血液运行不畅或体内离经止血未能消散，都成为瘀血[5]。

血小板聚集是血液运行不畅的一个重要原因，ADP 诱导血小板凝集法较为成熟[6]。凝血酶时间是指在血浆中加入标准化的凝血酶后血液凝固的时间。这些指标可作为评价药物活血功能的参考。实验表明，牡丹皮与赤芍均能抑制ADP 诱导的血小板凝集，两者配伍使用后抑制作用增强。说明牡丹皮、赤芍作为常用药对，可协同增强活血作用，具有组方合理性。

离经之血易形成血栓、血凝块[7]，本实验采用体外溶栓等实验，考察牡丹皮、赤芍及其两者配伍后的化瘀药效。结果表明，牡丹皮、赤芍均可提高血栓溶解率及全凝血块溶解率，且赤芍药效优于牡丹皮。两药配伍使用，溶栓及溶血疗效优于单独使用，合煎药液优于单煎后再混合药液。说明牡丹皮、赤芍配伍使用在化瘀作用方面具有合理性。

没食子酸、芍药苷、丹皮酚具有抗血小板聚集，溶解血栓的作用[8-10]，说明该成分与活血化瘀存在一定的联系。含量测定结果可见：①没食子酸含量：单煎再混合≤牡丹皮单煎+赤芍单煎≤合煎；②芍药苷含量：单煎再混合＜牡丹皮单煎+赤芍单煎＜合煎；③丹皮酚含量：再混合＜合煎＜牡丹皮单煎+赤芍单煎。由此可见，合煎可以促进没食子酸及芍药苷的溶出。再混合后，芍药苷含量降低，这可能是由于溶液微环境的变化导致芍药苷水解所致。丹皮酚含量则始终较低，可能由于丹皮酚水溶性差、熔点低、易挥发、不稳定等特点所致[11-12]。

药对是中医临床实践经验积累的结晶，是中医辩证施治、遣方用药的物质基础[13]。本研究分别从活血及化瘀两方面，设计体外药效实验方法。同时建立HPLC 同时测定没食子酸、芍药苷、丹皮酚含量的方法。实验结果表明，牡丹皮、赤芍药对配伍合煎能促进有效成分的溶出，协同增强活血化瘀药效，具有配伍合理性。该结果为深入阐明其配伍机制奠定一定的基础，同时也为临床合理用药提供支持。