RKIP、P27 表达与鼻咽癌发生、发展的关系*

龚永谦，罗兴谷，唐洪波

（南华大学附属第一医院 耳鼻咽喉科，湖南 衡阳 421001）

鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma,NPC）是中国南方及东南亚地区最常见的恶性肿瘤之一，是指发生在鼻咽腔顶部与侧壁的恶性肿瘤[1]。鼻咽癌的发病因素还不明确，除了遗传等因素外，还与环境、生活习惯等因素息息相关。Raf 激酶抑制蛋白（Raf kinase inhibitor protein,RKIP）属于磷脂酰乙醇胺结合蛋白的一种，是NF-κB 信号通路的内源性抑制子。近来研究发现[2]，RKIP 在NPC 组织中明显下调。P27 蛋白是一种细胞周期蛋白激酶抑制蛋白，可参与细胞周期调控[3]。研究显示，P27 蛋白表达水平与肿瘤的发生、发展、预后密切相关[4]。本研究探讨RKIP、P27 蛋白在鼻咽癌组织中的表达及与鼻咽癌发生、发展的关系，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2012年3月—2016年1月南华大学附属第一医院病理科收集的鼻咽癌黏膜组织76 例（病例组）和正常鼻咽组织30 例（对照组）。病例组：男性49 例，女性27 例；年龄42 ～78 岁，平均（59.3±11.5）岁；临床分期：Ⅰ期鼻咽癌患者12 例、Ⅱ期鼻咽癌患者20 例、Ⅲ期鼻咽癌患者30 例、Ⅳ期鼻咽癌患者14 例；经检查出现淋巴结转移50 例患者。对照组：男性23例，女性7 例；年龄44 ～75 岁，平均（57.0±12.0）岁。 两组的年龄、性别差异无统计学意义，具有可比性（P＞ 0.05）。

1.2 纳入及排除标准

1.2.1 纳入标准 ①鼻咽癌的诊断标准依据病理学结果；②患者年龄＜80 岁；③鼻咽癌组织在获取标本前，患者无放化疗病史；④正常鼻咽黏膜组织来源于因其他外科手术获取的患者；⑤本研究获得医学伦理委员会的批准。

1.2.2 排除标准 ①转移性鼻咽癌；②既往具有放化疗病史；③患者临床数据、基础资料不完整。

1.3 免疫组织化学染色

采用免疫组织化学染色法检测两组标本中RKIP、P27 蛋白的表达，将切片进行二甲苯脱蜡、梯度乙醇水化处理，使用SP 法检测RKIP 的表达，使用3%过氧化氢封闭内源性过氧化物酶15 min，3%牛血清清蛋白封闭1 h 处理，然后分别滴加1 ∶100 山羊抗人RKIP多抗和鼠抗人P27 单克隆抗体（美国Santa Cruz 公司），4℃过夜。冲洗后滴加生物素标记的驴抗兔IgG 工作液（武汉艾美捷科技有限公司），室温孵育1 h，滴加辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素工作液，孵育1 h。DAB 显色处理，苏木精复染，脱色后显微镜下观察。设计空白对照，以PBS 代替一抗，其他操作步骤相同。

1.4 免疫组织化学染色判断标准

细 胞 质、细 胞 膜 中 定 位RKIP、P27 蛋 白的阳性表达，阳性表达均表现为黄色甚至棕黄色，按照染色强度划分：无色（0 分）、淡黄色（1 分）、棕 黄 色（2 分）、褐 色 或 者 黑色（3分）；按照染色阳性的细胞比例划分：≤10% （1 分）、11%～50%（2 分）、51%～75%（3 分）、＞75% （4 分）；染色强度评分与阳性细胞比例评分之积＜3 分判断为阴性、≥3 分判断为阳性。染色强度评分与阳性细胞比例评分之积＜3 分（-）；染色强度评分与阳性细胞比例评分之积3 ～5 分（+）；染色强度评分与阳性细胞比例评分之积6 ～9 分（++）；染色强度评分与阳性细胞比例评分之积＞9 分（+++）。

1.5 统计学方法

数据分析采用SPSS 16.0 统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用t检验；计数资料采用率（%）表示，组间比较采用χ2检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组RKIP、P27 蛋白的表达率比较

两组RKIP 蛋白和P27 蛋白阳性表达率比较，差异有统计学意义（P＜0.05），病例组的RKIP 蛋白阳性表达率低于对照组，病例组的P27 蛋白阳性表达率高于对照组（见表1、2）。RKIP 蛋白在正常鼻咽组织中呈阳性表达，在鼻咽癌组织中呈阴性表达；P27 蛋白在正常鼻咽组织中呈阴性表达，在鼻咽癌组织中呈阳性表达（见图1、2）。

表1 两组RKIP 蛋白的表达率比较

表2 两组P27 蛋白的表达率比较

图1 RKIP 蛋白的表达 （SP×400）

图2 P27 蛋白的表达 （SP×400）

2.2 两组RKIP、P27 蛋白的表达与临床病理学特征的关系

发生远处转移的鼻咽癌患者、Ⅲ期和Ⅳ期鼻咽癌患者、发生淋巴结转移的鼻咽癌患者病灶组织中的RKIP 蛋白阳性表达率低于未发生远处转移的鼻咽癌患者、Ⅰ期和Ⅱ期鼻咽癌患者、未发生淋巴结转移的鼻咽癌患者，差异有统计学意义（P＜0.05）；RKIP 蛋白阳性表达与患者年龄、性别、T 分级无关（P＞0.05）。见表3。

发生远处转移的鼻咽癌患者、Ⅲ期和Ⅳ期鼻咽癌患者、发生淋巴结转移的鼻咽癌患者病灶组织中的P27 蛋白阳性表达率高于未发生远处转移的鼻咽癌患者、Ⅰ期和Ⅱ期鼻咽癌患者、未发生淋巴结转移的鼻咽癌患者，差异有统计学意义（P＜0.05）；P27 蛋白阳性表达与患者年龄、性别、T 分级无关（P＞0.05）。见表4。

表3 患者临床病理学特征与鼻咽癌组织中RKIP 蛋白 表达的关系 例（%）

表4 患者临床病理学特征与鼻咽癌组织中 P27 蛋白表达的关系

续表4

3 讨论

NPC 是指起源于鼻咽黏膜上皮和腺体的恶性肿瘤。世界卫生组织调查报道，全球有80%的鼻咽癌患者在中国[5]。近年来鼻咽癌在我国的发病趋势逐渐上升。随着鼻咽癌诊断、治疗水平的不断提高，中晚期鼻咽癌的疗效得到提高，但是患者的5年生存率仍然为70%[6]。针对细胞信号途径的分子靶向药物开创了肿瘤治疗的新时代，探索有效的肿瘤诊治靶点具有重要意义。

研究鼻咽癌相关基因是揭示鼻咽癌发生、发展机制的重要基础。RKIP 是一种转移抑制基因，作为调控多种信号转导通路的中心蛋白，参与G 蛋白偶联受体和NF-κB 等信号传导通路的调节[7]。RKIP 是NF-κB 信号通路的内源性抑制子，通过抑制IκB 激酶的活化来发挥NF-κB 信号通路负性调节的作用。侵袭、转移是鼻咽癌的主要生物学特征，也是影响患者预后的最重要的原因。研究显示[8-9]，RKIP 具有促进凋亡，抑制细胞生长和肿瘤转移的重要功能。研究发现[10]，RKIP 在多种癌症例如前列腺癌、肝癌、胃癌等多种肿瘤组织中表达下调。然而，RKIP 在NPC侵袭转移中的作用及其机制仍然不清楚。本研究数据表明，病例组的RKIP 蛋白阳性表达率低于对照组；发生远处转移的鼻咽癌患者、Ⅲ期和Ⅳ期鼻咽癌患者、发生淋巴结转移的鼻咽癌患者病灶组织中的RKIP 蛋白阳性表达率低于未发生远处转移的鼻咽癌患者、Ⅰ期和Ⅱ期鼻咽癌患者、未发生淋巴结转移的鼻咽癌患者；结果表明RKIP 蛋白在鼻咽癌的侵袭和转移中起到了重要的促进作用。

细胞周期是生命活动的基本过程，肿瘤细胞的发生、发展与细胞周期密切相关。RKIP 可以加速6-10B细胞越过G0/G1 期。因此笔者猜测，RKIP 通过影响肿瘤细胞的细胞周期发挥促进凋亡，抑制细胞生长和肿瘤转移的重要功能。P27 蛋白是一种新发现的非特异性的细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子（CKI）。主要功能是作为细胞周期素依赖性蛋白激酶（CDK）抑制因子参与细胞周期调控[11]。目前已有关于P27 蛋白与鼻咽癌临床参数的研究，但是尚无统一的定论，因此本研究在以往研究的基础上，探索鼻咽癌组织中RKIP 蛋白低表达与P27 蛋白是否相关。P27 作为抑癌基因的一种，是细胞周期负性调控因子，能抑制各种细胞周期蛋白和激酶的活性[12]。实验证明，P27 蛋白主要通过抑制Cydin-CDKs 复合物的活性来实现其对细胞周期的调控[13]。一方面P27 蛋白能抑制已被激活的CDK 活性，另一方面P27 蛋白也可以抑制CDK的激活过程，实现抑癌作用。研究显示[14]，P27 蛋白在多种癌症例如胃癌、食管癌、结肠癌等多种肿瘤中有抑癌作用。本研究结果显示，病例组的P27 蛋白阳性表达率高于对照组；发生远处转移的鼻咽癌患者、Ⅲ期和Ⅳ期鼻咽癌患者、发生淋巴结转移的鼻咽癌患者病灶组织中的P27 蛋白阳性表达率高于未发生远处转移的鼻咽癌患者、Ⅰ期和Ⅱ期鼻咽癌患者、未发生淋巴结转移的鼻咽癌患者。结果提示P27 的表达上升预示鼻咽癌肿瘤发生的可能性增加，并可能促进鼻咽癌的进展。P27 蛋白的异常表达可以作为评价鼻咽癌是否转移的一个指标。

综上所述，鼻咽癌组织中RKIP 蛋白低表达、P27蛋白高表达，并且与鼻咽癌肿瘤的发生、发展密切相关。深入研究RKIP、P27 蛋白在鼻咽癌细胞侵袭转移中的作用及其机制，对研发相应的靶向药物、提高临床疗效及改善鼻咽癌患者预后具有重要的临床意义。