急性髓细胞白血病患者CD96 和CD123 的表达及对预后的意义*

钟敏，苏群豪，胡敏，徐璐，陶石

（海南医学院第一附属医院 血液内科，海南 海口 570102）

白血病是由造血干/祖细胞分化、凋亡失调和恶 性增殖引起的一组异质性造血系统恶性肿瘤。大量研究表明，血液中有微量的细胞群，仅占白血病细胞的0.1%～1.0%，称为白血病干细胞[1]。这些细胞通常会导致白血病复发，对化疗药物敏感性降低，耐药性增加。急性髓细胞白血病（acute myelocytic leukemia,AML）是一种起源于髓系造血干/祖细胞的恶性肿瘤。临床表现包括贫血、出血、感染、发热、脏器浸润和代谢异常。大多数病例表现为急性和重度状态，预后较差。白血病干细胞的免疫表型在不同类型的白血病和个体间有差异，与临床特征、治疗反应、生存和预后有关[2]。作为免疫球蛋白超家族的成员，CD96 在大多数CD34+CD38+的AML 干细胞上表达。据报道，CD96 的表达与白血病干细胞的功能有关[3]。新近研究证实在不同的人AML 细胞移植小鼠模型中，所有的未成熟AML 亚群细胞中的白血病干细胞表达IL-3受体α 链（CD123）[4]。目前，AML 中白血病干细胞相关抗原CD123、CD96 表达与预后的关系尚不清楚。本研究探讨AML 中白血病干细胞相关抗原CD123、CD96 与疗效、预后的关系，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2011年1月—2013年6月海南医学院第一附属医院血液内科住院治疗的156 例AML 患者为研究对象。其中，男性86 例，女性70 例；年龄15 ～ 49 岁，平均（38.2±10.5）岁。所有患者诊断符合2016年WHO 修订版造血和淋巴组织肿瘤分类诊断标准[5]。FAB 分类：M1 27 例，M2 35 例，M3 25 例，M4 40 例，M5 29 例。选取同期在本院健康体检者150 例作为对照组。其中，男79 例，女71 例；年龄18 ～56 岁，平均（46.5±20.1）岁。所有患者都知情同意，并获得医院伦理委员会批准。

治疗方案及疗效标准：AML 患者除急性早幼粒细胞白血病（acute promyelocytic leukemia,APL）外采用三尖杉酯碱（HA）诱导治疗2 ～3mg/d，5 ～7 d 或米托蒽醌（NA）10mg/d，3 d，其次是阿糖胞苷150 ～ 300mg/d，巩固5 ～7 d。APL 患者主要用亚砷酸钠诱导，或亚砷酸和视黄酸双重诱导治疗。除化疗外，所有患者均给予输血、抗感染与综合支持治疗。疗效评价基于血液病诊断和规范治疗准则：①完全缓解（CR）：无贫血、出血、感染或白血病细胞浸润性表现；血红蛋白＞90g/L，白细胞正常或减少，无未成熟细胞，血小板＞100×109/L；原始细胞和早期细胞骨髓中的婴儿期细胞（或未成熟细胞）＜5%，正常红细胞和巨核系。②部分缓解（PR）：临床、血液和骨的3 个方面中的1 个或2 个方面骨髓不符合CR 标准；骨髓原始细胞和早期幼稚细胞＜20%。③无缓解（NR）：临床、血液和骨髓方面未能满足CR 骨髓中的原始细胞和早期幼稚细胞＞20%，包括无效患者。

所有患者随访5年，方式为电话或门诊，记录生存时间、化疗后感染、化疗后复发、髓外浸润等情况。

1.2 免疫分型检测

采用乙二胺四乙酸（EDTA）提取骨髓2 ～5ml。化疗前采用密度梯度离心法分离骨髓，用淋巴细胞分离液（Ficoll）分离单个核细胞。分别使用4 种颜色荧光标记的FITC-CD34、PE-CD38、PACP-CD123 及APC-CD96 抗体（购自美国BD 公司）检测细胞。室温避光孵育10 min。1 000 r/min 离心5 min，弃上清液，最后加入磷酸盐缓冲溶液（PBS）300 μl 混匀悬浮细胞，用流式细胞仪检测分析CD123、CD96 表达。FSC/SSC 排除碎片，SSC/CD45 作为空白对照，CD34+CD38-为造血干细胞。此外，CD123+是设置CD34+CD38-造血干细胞鉴定白血病干细胞。若是超过阴性对照20%就确定为抗原表达阳性。

1.3 统计学方法

数据处理采用SPSS 18 统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较用t检验；计数资料以例（%）表示，比较采用χ2检验；Kaplan-Meier 法绘制生存曲线，比较采用Log-rank-χ2检验；P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CD96、CD123 在AML 患者中的表达

AML 患者CD96 阳性表达率为（12.85±9.04）%，CD123 阳性表达率为（41.24±10.42）%；对照组：CD96 阳性表达率为（0.26±0.06）%，CD123 阳性表达率为（0.73±0.21）%；AML 患者的CD96 与CD123 阳性表达率与对照组比较，差异有统计学意义（t=12.300 和34.328，均P=0.000）。见图1。

2.2 AML 患者中CD96、CD123 表达与临床疗效的关系

AML 患者中CD96、CD123 阳性表达的缓解率低于CD96、CD123 阴性表达者，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

2.3 AML 患者CD96、CD123 表达与预后的关系

图1 AML 患者中CD96、CD123 的表达情况

表1 CD96、CD123 表达与临床疗效的关系 例

AML 患者中CD96、CD123 阳性表达的生存率低于CD96、CD123 阴性表达者，差异有统计学意义（P＜0.05）；AML 患者中CD96、CD123 阳性表达的化疗后感染、化疗后复发发生率高于CD96、CD123 阴性表达者，差异有统计学意义（P＜0.05）；AML 患者中CD96、CD123 阳性表达的髓外浸润发生率高于CD96、CD123 阴性表达者，但差异无统计学意义（P＜0.05）。见表2、3。

表2 AML 患者CD96 表达与预后的关系 [n =78，例（%）]

表3 AML患者CD123表达与预后的关系 [n =78，例（%）]

AML 患者中CD96 阳性表达与阴性表达患者中位生存期分别为（29.33±6.12）和（36.07±8.53）个月，差异有统计学意义（t=5.670，P=0.000）。AML 患者中CD123 阳性表达与阴性表达患者中位生存期分别为（30.51±10.01）和（35.77±8.91）个月，差异有统计学意义（t=3.467，P=0.001）。见图2。

图2 CD96、CD123 不同表达患者生存率比较

3 讨论

多项研究表明，AML 的发病与白血病干细胞密切相关[6]。白血病干细胞是一群具有自我更新能力的细胞群，可产生异质性白血病细胞群，在白血病细胞增殖、存活、转移和复发中起重要作用。针对靶向白血病干细胞的多种生物治疗方法，如CD33 单克隆抗体、CD44 单克隆抗体和IL-3 细胞因子偶联细胞毒素，取得良好的临床效果。白血病干细胞是由正常造血干细胞基因突变在发育过程中产生，因此具有与正常造血干细胞相同的表型，如CD34+CD38-、HLA-DR 和CD71。然而也有不同的表型与造血干细胞，如CD117和CD90。因此，检测白血病细胞表面特异性抗原标志物，预测疾病治疗反应及预后更具有重要的临床意义。

CD123 是IL-3 受体的α 亚基，在成人正常骨髓单核细胞中所占比例很低（0.1%～0.6%）[7]。相反，CD123 被发现在CD34-细胞的阳性率为2%。CD123广泛表达在大多数AML 原始细胞及白血病干细胞表面，且与AML 不良预后相关。有研究发现超过45%的AML 患者白血病细胞高表达CD123，且与AML 预后密切相关[8]。国外研究表明，CD34+CD38-CD123+细胞可诱导和维持白血病细胞，提示该组细胞具有白血病干细胞特征，CD34+CD38-CD123+可作为白血病干细胞的表面标志物[9]。

CD96 是免疫球蛋白超家族 CD226 亚家族的组成部分之一，已报道在T 和NK 细胞中表达，但在B 细胞、粒细胞、单核细胞或红细胞中不表达[10]。有报道称CD96 在AML 中表达率为30%，不受疾病亚型的影响[11]。有临床研究发现，AML 患者高表达CD96，且CD96 阳性表达患者缓解率更低，复发率高[12]。另外研究发现[13]，AML 患者CD96、CD123 表达率高于ALL 患者，且两者化疗缓解率差异有统计学意义，提示CD96 与AML 的耐药有关。

本研究结果发现，41.2%、12.8%的AML 患者白血病干细胞表达CD123、CD96，分别高于对照组患者。疗效分析显示CD123、CD96 阳性表达AML 患者的缓解率低于CD123、CD96 阴性表达患者，生存分析发现CD123、CD96 阳性表达AML 患者的化疗后感染、化疗后复发发生率更高，中位生存期更短。提示白血病干细胞高表达CD123、CD96 的AML 患者预后更差，为临床判断AML 患者预后及指导治疗决策提供简便易行的评估手段。

综上所述，通过对CD123、CD96 表达的检测可用于评价AML 患者化疗疗效及生存预后，分辨出耐药性高的患者，以便早期干预。同时，靶向CD123、CD96 的细胞免疫治疗成为今后研究的方向。不过还有待于大量的实验来验证，观察不同亚型患者CD96、CD123 表达情况及预后，这也是今后研究的方向之一。