不同品种梨果实酿制的梨酒中酚类物质及其抗氧化能力比较

李丽梅 冯云霄 何近刚 程玉豆 关军锋

(河北省农林科学院遗传生理研究所，河北 石家庄 050051)

酚类物质是果酒的“骨架成分”，是果酒的重要功能性成分，对果酒的口感和收敛性有决定性作用，同时影响着果酒的色泽、香气以及抗氧化性[1]。梨是中国传统种植水果，品种众多，在大部分省份都有种植。梨酒是近年来梨加工制品的研究热点，以鲜梨为原料，通过酵母菌发酵制成。目前关于梨酒的研究主要集中于生产工艺的优化[2-3]、酿酒酵母的分离筛选[4-5]、香气成分的分析[2,6-7]、理化品质分析[8-9]等方面，对梨酒中酚类物质的分析研究尚未见到相关报道。梨果实中含有酚类物质，在梨酒酿制过程中被浸渍到酒中，赋予梨酒丰富的口感和营养成分。梨[10-11]和葡萄[12]果实所含的酚类物质不同，可能造成梨酒和葡萄酒[13-14]的酚类组成和含量不同，但目前尚未有关于梨酒中酚类物质的含量和种类的报道。

本研究拟以鸭梨、雪梨、黄冠梨等11个品种梨为原料酿制梨酒，采用高效液相色谱法(HPLC)分析不同品种梨酒的酚类物质种类和含量，以DPPH·清除率为指标评价其抗氧化性能，以期能从品种选择、梨酒风味和营养评价等方面对梨酒的研究和开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

新鲜梨：鸭梨、雪花、黄冠、雪青、早酥红、红香酥、南水、晚秀、南果、新高、秋月，于成熟期采摘于河北省赵县范庄梨果种植基地，采收后入0 ℃贮藏；

甲醇、乙腈：色谱纯，百灵威科技有限公司；

熊果苷、没食子酸、绿原酸、(+)-儿茶素、槲皮素、原儿茶酸标准品：纯度≥98%，北京索莱宝科技有限公司；

咖啡酸、表儿茶素、芦丁标准品：纯度≥98%，北京世纪奥科生物技术有限公司；

3,4-二羟基苯丙氨酸标准品：纯度≥97.5%，北京世纪奥科生物技术有限公司；

商品化酵母菌株RC212：法国LAFFORT公司；

固相萃取小柱：Cleanert C18-SPE型，美国Agela Technologies公司；

高效液相色谱仪：HITACHI L-2000型，日本日立公司。

1.2 方法

1.2.1 梨酒酿制 取贮藏1个月的果实为材料进行试验，将梨果实去皮切分榨取果汁，加入蔗糖调整果汁糖度至22 °Brix，接种市售商品化酵母菌株RC212，接种量为0.02%，进行酒精发酵，发酵温度22 ℃，待糖度不再下降时发酵结束，一般发酵10 d倒罐，静置，自然澄清，得到不同品种梨酿制的梨酒。

1.2.2 酚类物质分析 参照文献[10]。

1.2.3 抗氧化性性能评价 参照文献[15]，DPPH·清除率按式(1)计算：

(1)

式中：

S——DPPH·清除率，%；

A0—— DPPH· 甲醇溶液的吸光度；

Ai——样品溶液的吸光度。

1.3 数据分析

采用统计分析软件JMP11.0(美国SAS公司)对数据进行显著性检验和相关性分析。

2 结果分析与讨论

2.1 不同品种梨酒的酚类物质种类和含量

参照酚类物质混合标准品色谱图(图1)的出峰时间，在11个品种梨酿制的梨酒中共分离鉴定出10种酚类物质，出峰时间依次是3，4-二羟基苯丙氨酸、熊果苷、没食子酸、原儿茶酸、儿茶素、绿原酸、咖啡酸、表儿茶素、芦丁和槲皮素。图2为酚类物质含量适中、具有代表性的雪花梨酒的色谱图。

由表1可知：

(1) 南果梨酒酚类物质总量最高，为316.35 μg/mL，早酥红、新高、雪青梨酒次之，分别为92.07，88.67，85.37 μg/mL，晚秀和雪花梨酒接近，分别是78.02，76.86 μg/mL，秋月和黄冠梨酒接近，分别是60.58，59.77 μg/mL，鸭梨、南水和红香酥梨酒最低，分别为44.37，40.91，37.70 μg/mL。南果梨酒比较特别，不但其酚类物质的总量最高，并且熊果苷、绿原酸、儿茶素、表儿茶素含量在11个品种梨酒中均最高。

1. 3,4-二羟基苯丙氨酸 2. 熊果苷 3. 没食子酸 4. 原儿茶酸 5. 儿茶素 6. 绿原酸 7. 咖啡酸 8. 表儿茶素 9. 芦丁 10. 槲皮素

图1 10种酚类物质混合标准品的HPLC色谱图

Figure 1 HPLC chromatogram of 10 kinds of phenolic standards

(2) 熊果苷在11个品种梨酒中含量均最高，占酚类物质总量的37%～68%，变异系数为97.92%，其中在南果梨酒中含量最高，达到188.765 μg/mL，但所占比例并非最高。在南水梨酒中含量最低，仅为16.694 μg/mL，但所占比例并非最低。

(3) 儿茶素在鸭梨、雪梨、雪青、早酥红和黄冠梨酒中含量排第二，在其他品种梨酒中含量排第三，其变异系数为71.18%，在南果梨酒中含量最高，为30.34 μg/mL，在红香酥梨酒中含量最低，为1.14 μg/mL。

(4) 3,4-二羟基苯丙氨酸在南果梨、红香酥、晚秀、南水和新高梨酒中含量排名第二，在其他品种梨酒中含量排第三。其变异系数为32.33%，在秋月梨酒中含量最高，为15.70 μg/mL，鸭梨酒中含量最低，为5.07 μg/mL。

(5) 绿原酸的变异系数最大为264.70%，仅在南果梨酒中含量高达66.17 μg/mL，仅次于熊果苷，排名第二；在雪梨酒中含量为5.61 μg/mL，在其他品种梨酒中则含量较低，不足3 μg/mL。

表1 不同品种梨酒的酚类物质组成

(6) 表儿茶素的变异系数为131.31%，在南果梨酒中依然表现突出，含量高达14.557 μg/mL，在新高和秋月梨酒中含量分别为4.99，3.99 μg/mL；在其他品种梨酒中含量不足2 μg/mL。

(7) 没食子酸、原儿茶酸、芦丁的含量在11个品种梨酒中均不足5 μg/mL，咖啡酸和槲皮素含量甚至不足2 μg/mL。原儿茶酸、儿茶素、咖啡酸和芦丁、槲皮素的变异系数为60%～80%，品种间差异明显。3,4-二羟基苯丙氨酸和没食子酸的变异系数分别是32.33%和34.61%，品种间有一定差异。

2.2 不同品种梨酒对DPPH·清除能力的比较

清除DPPH·是最为常见的体外检测抗氧化剂清除自由基的方法[15]。不同品种梨酿制梨酒对DPPH·的清除能力不同(图3)，按清除率大小依次是南果梨酒>新高梨酒>秋月梨酒>南水梨酒、雪青梨酒、晚秀梨酒、黄冠梨酒、雪梨梨酒>鸭梨梨酒、红香酥梨酒、早酥红梨酒。

酚类物质是葡萄酒中的主要抗氧化成分[16]。为了研究酚类物质和DPPH·清除率的关系，对不同品种梨酒中这11个变量进行偏最小二乘回归分析(PLS)，建立如下方程：

S=26.625 1+0.013 6×X1+0.042 8×X2+8.695 7×X3+0.506 0×X4，

(2)

式中：

S——梨酒对DPPH·清除率，%；

X1——熊果苷，μg/mL；

X2——绿原酸，μg/mL；

X3——咖啡酸，μg/mL；

X4——表儿茶素，μg/mL。

图3 不同品种梨酒对DPPH·的清除能力比较

Figure 3 Comparison of scarving capacity of DPPH radicals of different pear wine

由方程可知，对清除DPPH·有贡献的酚类物质有熊果苷、绿原酸、咖啡酸和表儿茶素[VIP>0.8(VIP，variable importance for projection，变量对于结果的重要性)]。

酚酸具有良好的抗氧化活性，特别是具有邻位羟基结构的酚酸[17]如咖啡酸，在本研究中由于其在PLS方程中系数最大，因此认为它对DPPH·清除率贡献最大。

酚类物质的抗氧化性与其结构有关[18]。它特有的酚羟基结构，具有供电子作用，通过提供活泼的氢捕捉机体内活性氧等自由基，阻断了自由基对机体的损伤。一般认为具有如下结构的酚类物质清除自由基能力强：① 不饱和C环上有3-羟基基团；② C环有2,3-双键、3-羟基基团和4-酮基基团；③ B环有邻位羟基基团，并且羟基没有被糖化。表儿茶素满足第一和第三个结构条件，所以具有强抗氧化性，在方程中显示出对清除DPPH·具有重要贡献。绿原酸是由咖啡酸和奎宁酸缩合而成的酯，属于酚类化合物。 由于分子具有邻二酚羟基，因此具有强还原性而易被自由基氧化[19]，从而表现出很好的自由基清除能力。

在苹果的酚类物质中，表儿茶素抗氧化能力最强[20]，卢娟芳等[21]报道在其研究的多个桃品种中，早露蟠桃含有的表儿茶素含量极高(238.79 μg/g·FW)，绿原酸含量一般(42.69 μg/g·FW)，但抗氧化能力最强，也说明了表儿茶素的抗氧化能力高于绿原酸。在本研究的PLS方程中，表儿茶素的系数远大于绿原酸，印证了这一观点。

除了羟基位置，羟基数目也影响抗氧化活性。羟基数目越多，可提供的氢原子越多，抗氧化活性越强[22]。熊果苷分子具有4个酚羟基基团，在本试验中对DPPH·清除率具有一定贡献。没食子酸和原儿茶酸分别具有3个和2个酚羟基基团，对DPPH·清除率的贡献均小于熊果苷(VIP<0.8)，因此未能进入方程。

3 结论

(1) 在11个品种梨酿制的梨酒中共分离鉴定出10种酚类物质。熊果苷在11个品种梨酒中含量均最高，其次是儿茶素和3,4-二羟基苯丙氨酸。绿原酸、表儿茶素仅在南果梨酒中含量较高，在其他品种梨酒中含量均较低。没食子酸、原儿茶酸、芦丁的含量在11个品种梨酒中均不足5 μg/mL，咖啡酸和槲皮素含量甚至不足2 μg/mL。南果梨酒酚类物质总量最高，为316.35 μg/mL，鸭梨、南水和红香酥梨酒最低，分别为44.37，40.91，37.70 μg/mL。

(2) 目前关于葡萄酒酚类物质的报道[23-25]大多是红葡萄酒，而对白葡萄酒的酚类物质研究则少有文献报道。研究者[18]在“西拉”“蛇龙珠”“赤霞珠” 所酿制的新鲜干红葡萄酒中，分离检测出了28种酚类物质，其中含量较高的酚类物质有龙胆酸、没食子酸、p-羟基苯甲酸、儿茶素、表儿茶素，杨梅素、槲皮甙等。由于红葡萄酒采用带皮发酵工艺，葡萄皮中富含的酚类物质，赋予了其丰富的多酚。而本研究所用梨酒为了保持梨酒的色泽和口感，参照了白葡萄酒去皮发酵的酿造工艺，因此梨酒的酚类物质组成和含量与红葡萄酒相差很多，期望后续有白葡萄酒的酚类物质研究报道和梨酒做此方面的比较。

(3) 不同品种梨酒对DPPH·的清除能力不同，依次是南果梨酒>新高梨酒>秋月梨酒>南水梨酒、雪青梨酒、晚秀梨酒、黄冠梨酒、雪梨梨酒>鸭梨梨酒、红香酥梨酒、早酥红梨酒。通过PLS分析得知，对清除DPPH·有贡献的酚类物质有熊果苷、绿原酸、咖啡酸和表儿茶素。

本试验仅就梨酒对DPPH·清除能力进行了测定，为了更好地评价梨酒的抗氧化能力还需要从清除羟自由基、超氧自由基等方面进行测定。同时本研究采用软件分析得出了对清除DPPH·有贡献的酚类物质，未来随着分离浓缩技术的进步，有望实现对低含量酚类物质的提取分离，从而验证其对自由基的清除能力，为开发保健品或药品提供新的原材料。