片仔癀对人结肠癌SW480细胞株的抑制作用研究

孙平良 黄深 欧海玲 韦龙祥 袁代解 耿曙光 刘佳丽 杨坤

结直肠癌（colorectal cancer）是最常见的消化道恶性肿瘤之一，其发病率位居世界恶性肿瘤发病率第2位，位居我国恶性肿瘤中第3位，且其发病率和死亡率均呈逐年上升趋势［1-2］。抗癌药物是肿瘤治疗的主要方式之一，作为FOLFOX联合化疗方案药物5-氟尿嘧啶（5-FU）在治疗结直肠癌中有着广泛的应用，但也存在严重的毒副作用以及耐药性等问题［3-4］。片仔癀是我国传统名贵中成药，由三七、麝香、牛黄及蛇胆等药物经独特生产工艺制作而成，具有清热解毒、散瘀消肿、活血止痛的功效［5］。大量的实验和临床研究结果表明，中药内服在防治肿瘤方面有着独特优势，其能降低肿瘤放化疗引起的毒副作用、减轻患者痛苦、改善患者生活质量等。但是，片仔癀等中药制剂治疗胃肠肿瘤的给药途径多为灌胃或内服，或者是体外实验而已，直接外用治疗肿瘤的研究报道少之又少。因此，能否找到一种增效减毒的中医中药外用方法治疗结直肠癌成为中医药界未来探究的一大方向。本研究通过观察片仔癀外用对人结肠癌SW480细胞株体内外的抑制效果，从而阐述其外用治疗结直肠癌的价值。

材料与方法

一、人结肠癌SW480细胞株体外实验

1. 主要材料：人结肠癌SW480细胞株购于ATCC细胞库，RPMI1640培养基购于Gibico公司，小牛血清购于Clarkbio公司，四甲基偶氮唑蓝（MTT）、二甲基亚砜（DMSO）均购于Sigma公司，5-FU购自上海旭东海普药业有限公司，片仔癀购自漳州片仔癀药业股份有限公司。配制前用刀片刮取漳州片仔癀，用50%的二甲基亚砜溶解配制成50 mg/mL，于 4 ℃保存待用。

2. 细胞培养：人结肠癌细胞SW480培养于含100 g/L小牛血清、1 kU/L青霉素、1 mg/L链霉素的 RPMI 1640培养基中，置于 37 ℃，50 ml/L CO2，200 ml/L O2的培养箱中，细胞贴壁生长后，每2 d更换培养基，每3 d传代1次。按5×106细胞加入冻存液1 mL的密度冻存。复苏时，从液氮罐中取出细胞，于37 ℃快速解冻，离心去除冻存液，加入培养液培养，细胞接种次日贴壁良好，接种后2～3 d 生长旺盛。

3. 细胞增殖活力检测（MTT法）：取对数生长期人结肠癌SW480细胞，调节细胞浓度为5×104个/mL，接种于96孔培养板，每孔加0.1 mL。按随机数字表法分为片仔癀组（药物浓度分 1 mg/mL，2 mg/mL，3 mg/mL，4 mg/mL，4 个亚组）、5-FU阳性对照组（浓度为10 μg/mL）和空白对照组，每组复种6孔。将细胞置于37 ℃，50 ml/L CO2，200 ml/L O2的培养箱中培养 24 h，去掉旧培养液。片仔癀组和5-FU阳性组每孔分别加入上述浓度含药培养液0.2 mL，空白对照组加入无药新鲜培养液 0.2 mL，继续置于 37 ℃，50 ml/L CO2，200 ml/L O2的培养箱中培养 48 h 后，每孔加入 0.5% MTT 20 μl，继续培养 4 h，去掉培养液，每孔加入二甲基亚飒（DMSO）100 μl，酶标仪上振荡30 s，于波长570 nm测定光密度（OD）值。抑制率=1-实验组OD值/对照组OD值×100%。细胞形态学观察：人结肠癌SW480细胞取用2 mg/mL 的片仔癀干预 24 h、48 h、72 h 后，在荧光显微镜下观察细胞的形态变化并拍照记录。

二、人结肠癌SW480细胞株体内实验

1. 实验动物：SPF级昆明种小鼠150只，雌雄各半，体重（20±2）g，同性别小鼠之间的体重相差不超过3 g，由广西医科大学实验动物中心提供，许可证号码：SCXK桂2014-20002。

2. 主要材料：细胞培养材料同人结肠癌SW480细胞株体外实验。抗荧光衰减封片剂、平衡盐溶液（PBS）、TUNEL细胞凋亡检测试剂盒（显色法）购于bioswamp公司，甲醛购于国药集团化学试剂有限公司。主要仪器有：正置显微镜（OLYMPUS公司，型号CX41），移液器（吉尔森P型移液器公司，型号P2、P10、P20、P100、P200、P1000），恒温烘箱（上海恒一科学仪器有限公司，型号DHG-9023A），石蜡切片机（徕卡显微系统有限公司，型号RM2235），摊片机（湖北康强医疗器械有限公司，型号TKD-TK），数码相机（NIKON公司，型号D5100）。

3. 建模方法：细胞培养同人结肠癌SW480细胞株体外实验。将已培养好的SW480结肠癌细胞去除培养瓶内培养基，用PBS冲洗培养瓶2次，加入体积分数为0.25的胰蛋白酶数滴消化，将消化好的细胞吸入离心管内，以600转/min的离心机离心6 min，弃上清，加入不含小牛血清的RPMI 1640培养基3 mL，吸管吹打混匀，再离心，弃上清，按每只小鼠皮下接种细胞数2.5×109/L，再加入无血清RPMI-1640培养基，供小鼠背部皮下接种用。准备好的人结肠癌SW480细胞悬液经台盼蓝染色活细胞数占95%以上，按每只0.2 mL人结肠癌SW480细胞悬液注射于消毒后的小鼠背部皮下，观察肿瘤移植成功率。

4. 实验分组给药：建模成功待瘤体生长约100 mm3后，将150只昆明小鼠随机分为模型组，片仔癀低、中、高剂量组和5-FU组，每组30只。片仔癀低、中、高剂量组药液浓度分别2、4、6 mg/mL，5-FU 组药液浓度为 0.8 mg/mL。均取5 mL溶液，以纱条浸润，完全吸收溶液后，外敷瘤处，每次外敷30 min；模型组以相同剂量的生理盐水外敷。每日2次，连用3 d，每日观察小鼠一般情况。

5. 抑瘤率：在治疗3 d后，以颈椎脱臼法处死各组小鼠，剥离肿瘤组织，称重，测量肿瘤长、宽及质量后，计算抑瘤率。抑瘤率以模型组和给药组肿瘤体积及瘤体质量的变化进行计算，肿瘤体积（TV）的计算公式为TV=a×b2/2，其中a、b分别表示瘤体的长、宽。肿瘤体积抑制率=1-（实验组平均瘤体积/对照组平均瘤体积）×100%，瘤重抑制率=（1-实验组平均瘤质量/对照组平均瘤质量）×100%。

6. 原位凋亡检测（TUNEL法）：切取每组小鼠瘤体组织块厚度约为0.2～0.3 cm，大小约为1.5 cm×1.5 cm×0.3 cm 制作石蜡切片。（1）对于石蜡切片：①二甲苯中脱蜡5～10 min，换新鲜的二甲苯再脱蜡 5～10 min，无水乙醇 5 min，90% 乙醇 2 min，70% 乙醇 2 min，蒸馏水 2 min；②用蛋白酶 K 工作液于 21℃ ～37℃中孵育 15～30 min；③PBS洗涤3次；（2）准备TUNEL反应混合液；（3）加入50 ul TUNEL检测液于样品上，在湿盒、暗室中加盖37 ℃孵育60 min；（4）用PBS冲洗3次；（5）用抗荧光衰减封片液封片后荧光显微镜下观察。观察10个高倍镜视野，以细胞核出现棕黄色颗粒为阳性细胞，计数1 000个癌细胞中的表达阳性数作为凋亡指数（AI）。

三、统计学分析

采用SPSS 19.0统计软件对两组实验数据进行统计分析，实验数据用均数±标准差表示，比较采用t检验，抑制率组间比较采用χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、人结肠癌SW480细胞株体外实验结果

各组对人结肠癌SW480细胞株体外抑制结果，经皮尔森（Pearson）卡方检验得出1 mg/mL、2 mg/mL、3 mg/mL 组抑制率与 5-FU 组比较，差异具有统计学意义（χ2=4.49，4.97，4.52；均P＜0.05）；4 mg/mL组抑制率与5-FU组比较，差异无统计学意义（χ2=3.57，P＞0.05）；2 mg/mL组抑制率与1 mg/mL、3 mg/mL组比较，差异无统计学意义（χ2=0.01，0.01；均P＞0.05）；见表1。荧光显微镜显示空白组与2 mg/mL片仔癀组不同时间段人结肠癌SW480细胞株数量比较，后者均显示不同程度的显著减少、体积变小、折光性差、细胞悬浮、脱落死亡，见图1。

二、人结肠癌SW480细胞株体内实验结果

各组对人结肠癌SW480细胞株体内抑制结果经皮尔森（Pearson）卡方检验显示，片仔癀高、中、低剂量组对人结肠癌SW480细胞的体内抑瘤率分别为51%、39%、23%，其中高、中剂量组与5-FU组比较差异无统计学意义（χ2=0.05，0.49；均P＞0.05），低剂量组与5-FU组比较差异有统计学意义（χ2=4.09，P＜0.05），高、中剂量组的组间比较显示差异无统计学意义（χ2=0.87，P＞0.05），具体见表2。荧光显微镜显示片仔癀各剂量组和5-FU组对人结肠癌SW480细胞均有不同程度的凋亡反应。

表1 各组对人结肠癌SW480细胞株体外抑制率

表2 各组对人结肠癌SW480细胞株体内抑制率

图1 空白组与2 mg/mL片仔癀细胞凋亡荧光检测图。空白组的细胞胞质均匀，核仁清晰，细胞壁完整，伸展性良好，生长速度较快；2 mg/mL片仔癀干预后可发现的细胞形态的显著改变，人结肠癌SW480细胞数量逐渐减少，细胞胞质浑浊，体积缩小，折光性较差，细胞数量悬浮、凋亡脱落；1A：空白对照组；1B：2 mg/mL片仔癀干预24 h对人结肠癌SW480细胞体外抑制；1C：2 mg/mL片仔癀干预48 h对人结肠癌SW480细胞体外抑制；1D：2 mg/mL片仔癀干预72 h对人结肠癌SW480细胞体外抑制

图2 各组体外细胞凋亡荧光检测图。较空白组，各治疗组干预后可发现的细胞形态的显著改变，人结肠癌SW480细胞数量逐渐减少，折光性较差，细胞数量悬浮、凋亡脱落。2A：空白对照组；2B：5-FU组对人结肠癌SW480细胞体内抑制；2C：2 mg/mL片仔癀低剂量对人结肠癌SW480细胞体内抑制；2D：4 mg/mL片仔癀中剂量对人结肠癌SW480细胞体内抑制；2E：6 mg/mL片仔癀高剂量对人结肠癌SW480细胞体内抑制

讨 论

结直肠癌属于中医“锁肛痔”“肠覃”“积聚”“肠癖”等范畴。中医认为结直肠癌发病的主要病机病因是“湿热瘀毒”，以清热解毒，活血化瘀为治疗原则。现代医学对结直肠癌的治疗以手术、化疗、放疗等治疗为主，但大部分患者发现时结直肠癌多属晚期，常合并有肠穿孔、肠梗阻、癌性疼痛等并发症，致手术难度大，预后较差。随着该病发展，患者的5年生存率大幅下降［6］。中药内服在防治肿瘤方面有着独特优势，中药外用亦取得显著疗效，特别是对于那些低位结直肠癌患者。

片仔癀是我国传统名贵中成药，由三七、麝香、牛黄、蛇胆等药物经独特生产工艺制作而成，具有清热解毒、散瘀消肿、活血止痛的显著功效［5］。其中三七散瘀止血、消肿定痛、行滞通脉，牛黄清热泻火，蛇胆清热解毒。其广泛用于热毒血瘀所致急慢性病毒性肝炎、痈疽疔疮、无名肿毒及各种炎症的治疗［7］。

5-FU抑瘤的机制主要是其在细胞内转变为5-氟尿嘧啶脱氧核苷酸（5F-dUMP），而抑制脱氧胸苷酸合成酶，阻止脱氧尿苷酸（dUMP）甲基化转变为脱氧胸苷酸（dTMP），从而影响DNA的合成［8］。5-FU对结直肠癌细胞具有抑制作用，但因其副作用大，临床上需与其他药物合用以降低副作用。

本实验通过对比不同剂量的片仔癀和5-FU对人结肠癌SW480细胞进行体内外干预，观察其抑瘤率及凋亡情况。从人结肠癌SW480细胞株体外实验得出：片仔癀各组对SW480细胞有着显著的抑制效果，其中，1 mg/mL、2 mg/mL、3 mg/mL组的体外抑制作用甚至优于5-FU，但不同剂量间的差别却并不明显，这可能与实验设计剂量阶梯差异不足够明显有关，亦或是SW480细胞对片仔癀的剂量变化本身并不敏感。在SW480细胞体内实验中，发现各组对结肠癌均有不同程度的抑制作用，其中，片仔癀中、高剂量组（4 mg/mL、6 mg/mL）对人结肠癌SW480细胞株体内抑制作用与5-FU相近，两者差异无统计学意义；而低剂量组的抑制率则不如中、高剂量组。这提示临床应用中采用高剂量可能取得更好效果，但这一结果与体外实验并不相同，可能与动物模型或体内环境有关，具体原因仍然需要后续进行更多动物模型运用及不同剂量的调试验证。

根据图2的实验结果分析，当细胞凋亡发生时，会激活一些DNA内切酶，这些内切酶会切断核小体间的基因组DNA；细胞凋亡时抽提DNA进行电泳检测，可以发现 180～200 bp 的 DNA ladder；基因组DNA断裂时，暴露3′-OH可以在末端脱氧核苷酸转移酶的催化下加上绿色荧光探针荧光素标记的dUTP，从而可以通过荧光显微镜检测。基于该原理得出：①在体外实验中，空白组的细胞胞质均匀，核仁清晰，细胞壁完整，伸展性良好，生长速度较快；2 mg/mL片仔癀干预后可发现细胞形态的显著改变，人结肠癌SW480细胞数量逐渐减少，细胞胞质浑浊，体积缩小，折光性较差，细胞数量悬浮、凋亡脱落；②在体内实验中，各治疗组荧光显示均弱于空白组，说明各组对人结肠癌SW480细胞均有一定程度的抑制作用。

近年来，随着中医中药治疗结直肠癌的不断深入研究，其在治疗结直肠癌中取得很好的效果，研究表明白花蛇舌草、败酱草、莪术和白首乌等具有抗肿瘤作用［9-12］。片仔癀能明显改善晚期癌症患者疼痛、缩小瘤体、延长生命、提高生活质量等［13-14］。片仔癀直接干预结肠癌细胞培养基可以抑制结肠癌株干细胞增殖、调控ABCC1抑制结肠癌等［15-16］。片仔癀外敷肿瘤组织能有效缓解中晚期肝癌症状，对骨肉瘤及体外结肠癌细胞增殖具有显著抑制作用，且其具有多层次、多途径、多靶点的作用特点，可改善晚期结直肠癌患者生活质量，延缓病情进展等［17-18］。片仔癀外用主要是通过线粒体依赖性途径诱导大肠癌细胞凋亡、抑制大肠癌细胞的增殖、抑制肿瘤血管新生、抑制多条大肠癌相关信号转导通路等多方面共同起效的。但是，以上片仔癀治疗结肠癌的研究，给药途径均是体外实验或者使用片仔癀灌胃的方式来进行的，尚未发现有片仔癀在机体外用直接干预肿瘤的研究报道。

本次实验通过不同浓度片仔癀直接干预人体结肠癌SW480细胞株在培养基中的增殖及外敷人体结肠癌小鼠体表瘤组织，经治疗后表现出明显的抑瘤作用，且对片仔癀产生浓度依赖性。在临床上，中医中药外治如局部外敷、熏洗、烫疗及中药保留灌肠等对肿瘤患者具有一定的疗效，譬如中药保留灌肠治疗低位结直肠癌。随着科研检测技术的不断发展及对中药药理的不断认识，中医中药外用有望成为治疗结直肠癌的一种有效治疗方法。