不同因素对IVF实验室试剂潜在胚胎毒性的影响

邱枫 饶金鹏

【摘要】 目的：探討体外受精（IVF）胚胎培养液分装与否及开封时间长短对质量的影响，以降低因试剂不合理使用导致实验室不良情况发生，进而降低不良妊娠结局发生率。方法：分别将待检测的卵泡冲洗液、配子处理液、受精液、卵裂液、囊胚培养液取出1/2体积在无菌条件下分装;余下1/2未分装试剂同分装试剂均于-4 ℃保存0、14、28 d。在0、14、28 d时，以质控合格的精子冲洗培养液为对照，分装及未分装试剂加或不加血清平衡过夜后进行精子存活试验（human sperm motility assay，HSMA），72 h后计算并比较精子存活指数。结果：分装及未分装试剂精子存活指数均>0.85。分装及未分装试剂在同一时间点检测，受精液精子存活指数均为最高，卵裂液精子存活指数均为最低。同一时间点检测，分装试剂精子存活指数均高于未分装，差异均无统计学意义（P>0.05）。试剂在分装及未分装条件下检测，0 d精子存活指数高于14、28 d，14 d精子存活指数高于28 d，差异均无统计学意义（P>0.05）。结论：分装及未分装试剂在开封后28 d内，虽均未表现出明显的胚胎毒性，但精子存活指数随放置时间增加均有下降趋势。因此，试剂开封后28 d内应尽量缩短储存时间。在相同时间点，分装与否对潜在胚胎毒性均无明显影响，但分装可能会减少试剂的污染。因此，试剂未能一次性使用完毕应进行分装。

【关键词】 IVF实验室试剂 胚胎毒性 精子存活试验 分装 开封时间

[Abstract] Objective： To investigate the effect of packaging and the opening time of IVF embryo culture solution on the quality， so as to reduce the occurrence of adverse laboratory conditions caused by irrational use of reagents， and then to reduce incidence of adverse pregnancy outcomes. Method： ASP， G-MOPS， G-IVF， G-1， G-2 to be tested were separately taken out of 1/2 volume and packed under sterile condition. The remaining 1/2 non-packed reagents and packed reagents were stored at -4 ℃ for 0， 14 and 28 days. At 0， 14 and 28 days， qualified HTF as the contrast， and the sperm motility assay was carried out through the packed reagents and non-packed reagents combined with serum balance after overnight. Sperm motility indexes were calculated and compared after 72 h. Result： The sperm motility indexes of packed and non-packed reagents were greater than 0.85. Packed reagents and non-packed reagents were tested at the same time， sperm motility indexes of G-IVF were the highest， and sperm motility indexes of G-1 were the lowest. At the same time， sperm motility indexes of packed reagents were higher than those of non-packed reagents， but the differences were not statistically significant （P>0.05）. The reagents were tested under the conditions of packed and non-packed， the sperm motility indexes at 0 d were higher than 14 and 28 d， and the sperm motility indexes at 14 d were higher than 28 d， but the differences were not statistically significant （P>0.05）. Conclusion： Although no significant embryotoxicity was observed in packed reagents and non-packed reagents within 28 days after opening， the sperm motility indexes tended to decrease with the increase of storage time， so the use time of reagents should be shortened as much as possible within 28 days after opening. At the same time， there was no significant effect on potential embryotoxicity between packed and non-packed. However， packed may reduce the contamination of reagents. Therefore， reagents should be packed if they can not be used at one time.

严格的实验室质量控制与质量保障系统是配子和胚胎生长发育的必要条件，对维持IVF成功率具有重要作用[1-2]。在体外受精过程中，配子及胚胎对培养环境要求很高，培养液作为与配子及胚胎直接接触的微环境，其成分、pH值、渗透压及内毒素任何一项发生改变都可能影响配子及胚胎的正常发育，直接影响IVF妊娠率，甚至导致不良妊娠结局的出现。因此，培养液对配子及胚胎体外培养至关重要。人精子存活试验（human sperm motility assay，HSMA）建立于20世纪80年代，可通过观察精子活力变化检测培养液是否存在胚胎毒性，尤其对低含量的毒性非常敏感，目前已被广泛应用于临床工作中质控新入库试剂及耗材[3]。对于新建IVF实验室，IVF周期数较少，培养液使用量小，导致试剂储存时间延长，存在有效期内试剂过剩现象。在实验室冰箱2 ℃～8 ℃储存条件下，试剂是否分装及开封时间长短对试剂胚胎毒性的影响尚缺乏考证。为了使试剂得到合理使用，减少浪费的同时避免因储存时间过久、打开次数过多导致配子及胚胎异常发育，本研究通过HSMA比较IVF实验室试剂分装与否及开封时间长短对试剂潜在胚胎毒性的影响。

1 资料与方法

1.1 一般资料

1.1.1 研究对象 36份精液标本均来自2019年1-7月于笔者所在医院生殖医学中心门诊就诊的健康生育男性，年龄20～35岁;否认酗酒、嗜烟、吸食大麻等不良嗜好;精液体积、精子浓度、总数、活动率等参数均正常（具体标准参照世界卫生组织精液分析第五版[4]）。

1.1.2 试验试剂 精子密度梯度液（美国SAGE Pure Ception 40%，80%）、精子洗涤液（mHTF）、卵泡冲洗液（ASP）、配子处理液（G-MOPS）、受精液（G-IVF）、卵裂液（G-1）、囊胚培养液（G-2），均购自瑞典vitrolife公司。G-MOPS、G-IVF、G-1、G-2使用前按要求加入10%血清，除G-MOPS于前1 d配置，置于37 ℃培养箱外，其余培养液均于前1 d配置，置于37 ℃、6% CO2培养箱中培养过夜。将待检测的ASP、G-MOPS、G-IVF、G-1、G-2取1/2体积在无菌条件下分装，余下1/2未进行分装。以质控合格的mHTF为对照。

1.1.3 耗材与设备 标准垂直净化工作站（苏州智净 SW-CJ-1FD）、高速离心机（美国 THERMO SL16R）、相差显微镜（日本 OLYMPUS CX31）、恒温培养箱（美国 THERMO3111）、Markler计数板（以色列 SELF-MEDICAL）、彩色精子质量检测系统（北京伟力 WLJY-9000）、移液枪（eppendorf）;无菌取精杯、15 ml离心管、3 ml圆底试管、无菌移液管（美国BD Falcon公司）。

1.2 方法

1.2.1 精子存活试验 待精液完全液化后，用精子质量检测系统检测精子各项参数。取15 ml离心管，将1 ml 80%的密度梯度液加入离心管底部，1 ml 40%的密度梯度液缓慢沿管壁加在80%的密度梯度液上层，两液间有一清晰分层。平衡至室温后，将精液缓慢沿管壁加在40%的密度梯度液液面上，以400 r/min离心20 min后去除上层精液及密度梯度混悬液（puresperm混悬液），加入5 ml已质控合格的mHTF，吹打混匀后以200 r/min离心5 min，丢弃上清液，重复洗涤两次。沿管壁缓慢加入0.5 ml mHTF上游，30～40 min后，取出上层精子悬浮液，用Markler计数板计数后加入mHTF及待检测培养液中，调精子终密度为5×106/ml。根据试剂要求置于通或不通37 ℃、6% CO2的培养箱中培养，每隔24小时混匀精子做精液分析，72 h后计算并比较精子存活指数。若精子存活指数>0.85说明试验合格，否则表明该培养系统存在潜在胚胎毒性[5]。

1.2.2 分装培养液 分别将待检测ASP、G-MOPS、G-IVF、G-1、G-2取出1/2体积在无菌条件下分装到质控合格的3 ml圆底试管，标记分装试剂名称、分装时间及体积，并用封口膜封闭;余下1/2未分装试剂同分装试剂均于-4 ℃保存0、14、28 d，标记开封时间后用封口膜封闭。

1.3 观察指标

在0、14、28 d时，以质控合格的mHTF为对照，以上5种分装及未分装试剂加或不加血清平衡过夜后进行HSMA，于72 h后在显微镜下计算质控合格的mHTF、5种分装及未分装试剂精子存活率，计算并比较精子存活指数。精子存活指数=5种分装及未分装试剂精子存活率/质控合格的mHTF精子存活率。

1.4 统计学处理

采用SPSS 19.0统计学软件对数据进行统计分析，计量资料以（x±s）表示，采用t检验，计数资料以率（%）表示，采用字2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

5种分装及未分装试剂精子存活指数均>0.85，均合格。分装及未分装试剂在同一时间点检测，G-IVF精子存活指数均为最高，G-1精子存活指数均为最低。同一時间点检测，分装试剂精子存活指数均高于未分装试剂，差异均无统计学意义（P>0.05）。试剂在分装及未分装条件下检测，0 d精子存活指数高于14、28 d，14 d精子存活指数高于28 d，差异均无统计学意义（P>0.05），见表1。

3 讨论

人类辅助生殖技术包括体外受精、胚胎体外培养、胚胎移植等过程，这些过程均离不开胚胎培养液，质量稳定可靠的培养液直接关系到辅助生殖技术的每个过程，从而最终影响试管婴儿妊娠率。目前使用的培养液都含有相对不稳定的成分，比如氨基酸和维生素等[3]。虽然IVF商品化试剂出厂前经过严格试剂质控，运输过程亦使用标准冷链系统，但不同培养液、不同批号的同种培养液的质量都是有差别的。另外，季节性及供应途中保护措施不当均会影响培养液质量[6]。为确保试剂质量，试剂入库前仍需经过实验室严格质控[7-8]。常用的质控方法有化学质控和生物学质控，化学质控有pH检测、渗透压测定、内毒素测定;生物学质控方法有精子存活试验、人类卵母细胞/胚胎培养法、小鼠胚胎生物检测、体细胞增殖试验[9-10]。人精子存活试验取材方便经济，对低含量的毒性成分十分敏感，常被应用于测定试剂质量和毒性工作中[9]。同时，人精子存活试验能预测卵细胞的质量和受精结局，是一种价值较高的质控方法[11]。本研究通过人精子存活试验对不同因素影响的IVF培养液进行检测质控，结果显示，本批次的培养液均质控合格。

IVF培养液的运输和储存均能影响其稳定性。IVF实验室对于培养液的存放一般要求不改变培养液的性质，将细菌污染风险降到最低。一般情况下，微生物在10 ℃以下发育可被显著抑制，故培养液一般储存于2 ℃～8 ℃环境中，并且在使用时尽量缩短培养液暴露于室温下的时间[12]。对于新建IVF实验室，由于周期数少，试剂开封后可能会多次使用，随着试剂使用频率的增加，培养液在室温下暴露的时间随之增加。如果对培养液进行分装可减少其在室温下暴露时间，并减少开封次数，但也会增加IVF成本。本研究通过比较分装与未分装状态下培养液在28 d内的质量，结果显示，分装与未分装状态下，在0、14、28 d时培养液均质控合格，且在同一时间点，分装试剂精子存活指数与未分装试剂精子存活指数比较，差异均无统计学意义（P>0.05），说明在28 d内分装与未分装试剂对培养液质量并无显著影响。因此，各实验室可按需求来决定分装与不分装试剂。但从细菌学角度来讲，分装试剂可在一定程度上减少试剂污染，建议新建IVF实验室对试剂进行分装，同时也可减少试剂浪费。

目前，商品化试剂均为含有氨基酸等各种成分的培养液，每种成分的储存条件各不相同，如培养液中含有的青霉素、链霉素在水溶液中十分不稳定，随着时间的延长，成分分解越多[5]。因此，储存试剂不可能使每种成分达到最佳储存状态，相对不稳定的成分会在一定时间内较早失去其应有的性能。每种试剂都有相应保质期，但开封后分装与未分装试剂在储存一定时间后是否质控合格尚未得知。本试验通过比较开封后保存0、14、28 d相应试剂的精子存活指数，结果显示，28 d内各种试剂的精子存活指数均在0.85以上，不同时间点精子存活指数比较，差异均无统计学意义（P>0.05），说明在28 d内培养液质量未受到明显影响。但无论哪种试剂，随着时间的延长，精子存活指数均呈下降趋势，即培养液的质量呈下降趋势。保存28 d仍在质控范围内，故试剂开封后应尽快使用，根据每个实验室周期数量及储存条件不同，选择合适的丢弃时间，以防影响实际应有的性能。本试验尚存在一些不足，如未能检测储存更长时间的培养液质量。后期可在已有数据的基础上根据本试验的条件探究储存更长时间的培养液质控如何，减少试剂浪费的同时降低胚胎毒性。

参考文献

[1]黄国宁，刘东云，韩伟.辅助生殖技术实验的建设及其质量控制[J].中国实用妇科与产科杂志，2010，26（10）：755-758.

[2] Saghooni N M，Amirian M，Sadeghi R，et al.Effectiveness of infertility counseling on pregnancy rate in infertile patients undergoing assisted reproductive technologies：a systematic review and meta-analysis[J].International Journal of Reproductive BioMedicine，2017，15（7）：391-402.

[3]黄国宁.辅助生殖实验室技术[M].北京：人民卫生出版社，2014：131-133.

[4]世界卫生组织.世界卫生组织人类精液检查与处理实验室手册[M].第5版.北京：人民卫生出版社，2011：10-35.

[5]黄国宁，孙海翔.体外受精-胚胎移植实验室技术[M].第1版.北京：人民卫生出版社，2012：35，228.

[6]赵济华，曹云霞，周平，等.人精子存活试验对辅助生殖技术实验室质量控制的评价[J].中国妇幼保健杂志，2005，20（14）：1714-1716.

[7] Matson P L.Internal quality control and external quality assurance in IVF laboratory[J].Human Reproduction，1998，13（Suppl 4）：156-165.

[8] Gianaroli L.ESHRE guidelines for good practice in IVF laboratories[J].Human Reproduction，2000，15（10）：2241-2245.

[9] Claassens O E，Wehr J B，Harrison K L.Optimizing sensitivity of the human sperm motility assay for embryo toxicity testing[J].Human Reproduction，2000，15（7）：1586.

[10] Critchlow J D，Matson P L，Newman M C，et al.Quality control in an invitro fertilization laboratory use of human sperm survival studies[J].Human Reproduction，1989，4（5）：545-550.

[11] Hossain A M，Rizk B，et al.Human sperm bioassay has potential in evaluating the quality of cumulus-oocyte complexes[J].Archives of Andrology，1996，37（1）：7.

[12]孫丹丹，卢士玲，李开雄，等.贮藏温度对冷鲜羊肉微生物菌群生长变化的影响[J].食品工业科技，2017，4（38）：327-331.

（收稿日期：2019-10-10） （本文编辑：李盈）