载脂蛋白基因apo和gltP对普鲁兰多糖合成的影响

郭 建，黄思瑶，郑 鹏，陈叶福，郭学武，肖冬光

(工业发酵微生物教育部重点实验室，天津科技大学生物工程学院，天津 300457)

普鲁兰多糖是由出芽短梗霉合成的一种胞外多糖，它由麦芽三糖以α-(1→6)糖苷键反复连接而成[1]．特殊的化学结构赋予普鲁兰多糖优良的性质，它黏度大、水溶性极强，在化工、食品、医药等行业应用广泛．普鲁兰多糖可作为增稠剂，也能用于生产可被微生物降解的薄膜，还可作为低卡路里食品直接食用[2]．

普鲁兰多糖的合成是一个复杂过程．磷酸葡萄糖变位酶、葡萄糖焦磷酸化酶、葡萄糖基转移酶可能是普鲁兰多糖合成过程中的关键酶[1]．Li等[3]过表达葡萄糖焦磷酸化酶基因后发现，普鲁兰多糖产量提升了1.3倍．Chen等[4]验证了几个葡萄糖基转移酶基因的功能，发现其中1个葡萄糖基转移酶基因对普鲁兰多糖产量有促进作用．以上实验结果同推测的普鲁兰多糖合成途径相互印证．除了上述关键酶外，糖脂中间体 lipid-G对多糖的合成也至关重要[5]．糖脂中间体 lipid-G是由脂类物质与尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG)结合而成的[5]．已有的文献[3-4]报道都是从增加 UDPG含量的角度来增强普鲁兰多糖的合成，并未考虑脂类物质对糖脂中间体lipid-G的影响．

载脂蛋白(apolipoprotein)对脂类物质的合成和运输均有较大影响[5-6]，脂类物质对于糖脂中间体的形成至关重要．脂类物质含量的增加能够促进糖脂中间体的形成，作为普鲁兰多糖合成的基本单元，足量的糖脂中间体无疑会促进普鲁兰多糖的合成．出芽短梗霉所产脂类物质的主要成分为重油[1]，但是重油在普鲁兰多糖合成中的作用还未见报道，由此可以推测其可能参与糖脂中间体 lipid-G的合成．基于以上认识，本研究以出芽短梗霉(A.pullulans)CBS110374菌株为研究对象，通过敲除和整合过表达，考察了出芽短梗霉载脂蛋白基因 apo和 gltP对普鲁兰多糖及重油合成的影响，这有助于深入认识普鲁兰多糖合成过程．

1 材料与方法

1.1 菌株与试剂

出芽短梗霉(A.pullulans)CBS110374购自荷兰CBS菌种保藏中心，所用工程菌株 OA21、OG5、Δapo和ΔgltP为本实验构建．

DNA 聚合酶、dNTP，Takara公司；D9515崩溃酶、L4025消解酶、Trizma碱，Sigma公司；潮霉素B，上海索宝生物科技有限公司；山梨醇，上海迈瑞尔化学技术有限公司；甲醇，天津市北方天医化学试剂厂；无水乙醇，天津市申泰化学试剂有限公司．

1.2 培养基及培养条件

YEPD培养基(g/L)：蛋白胨20，酵母粉10，葡萄糖 20，固体培养基中加入琼脂粉 15，121℃灭菌20min．

HCS培养基(g/L)：葡萄糖 10，酵母浸粉 3，牛肉粉 1，蛋白胨 10，麦芽粉 3，固体培养基中加入琼脂粉 15，pH 5.7，115℃灭菌 20min．HCS培养基双层培养基的下层 HCS培养基添加终质量浓度为50mg/L的潮霉素，上层HCS培养基不添加潮霉素．

种子培养基(g/L)：葡萄糖 20，硫酸镁 0.4，酵母粉 1.2，硫酸铵 1.0，NaCl 4，K2HPO44，pH 6.0，115℃灭菌20min．

发酵培养基(g/L)：葡萄糖 50，硫酸镁 0.2，酵母粉 0.8，硫酸铵 0.8，NaCl 2，K2HPO46，pH 6.5，115℃灭菌20min．

种子培养条件为 28℃、200r/min培养 24h，发酵培养条件为28℃、220r/min培养7d．

1.3 重组菌株构建

重组菌株的构建采用同源重组依赖型 DNA装配方法[7]，过表达gltP基因的菌株的构建过程参考文献[7]．所用引物(表1)由金维智生物技术有限公司合成，下划线表示片段间重叠的碱基．

表1 引物Tab. 1 Primers

续 表

同源重组依赖型 DNA装配方法为相邻片段引物设计方法，在 rDNA 基因(Genbank NO.AY139394.1)位点整合过表达apo或gltP基因，如图1所示．前期研究[7]发现出芽短梗霉拥有高效的同源重组修复机制，基于这种机制在设计引物时于引物末端加入同源序列，然后将待整合片段导入细胞内，即可在细胞内完成片段连接并整合到设计好的位点．

图1 同源重组依赖型 DNA装配方法引物设计原则及整合过表达apo或gltP示意图Fig. 1 Principles of homologous recombination dependent DNA assembly method and the schema of integrating overexpression of apo or gltP

1.3.1 转化片段准备

在rDNA位点过表达apo基因(JGI protein ID：84794)需要 6个片段，即 HPT片段、rDNAU片段和rDNAD片段，PGKP5(磷酸甘油酸激酶基因启动子)用引物 PGKPF/PGKP5R扩增，apo片段(apo基因)用引物 apoU/apoD 扩增，PGKt5(磷酸甘油酸激酶基因终止子)用引物PGK5tF/PGKtR扩增．敲除apo基因需要 3个片段，apo基因上同源臂用引物ApoUs/ApoUa扩增，apo基因下同源臂用引物ApoDs/ApoDa扩增，潮霉素抗性基因用引物HPT3s/HPT3a扩增．

敲除 gltP基因需要 3个片段，gltP基因上同源臂用引物 gltPU1s/gltPU1a扩增，gltP基因下同源臂用引物 gltPD1s/gltPD1a扩增，潮霉素抗性基因用引物HPT4s/HPT4a扩增．

1.3.2 出芽短梗霉转化

出芽短梗霉采用电转化方法：取1环出芽短梗霉接种于5mL的YEPD试管中，28℃、200r/min培养24h；取 2mL菌液接种于装液量为 50mL YEPD的250mL 三角瓶中，28℃、200r/min培养 24h；2mL菌液移至 2mL灭菌离心管，4℃、12000r/min离心2min，收集菌体，可重复多次以获得足量菌体；用1mol/L山梨醇溶液将菌体重悬，4℃、12000r/min离心2min，收集菌体；加入1mL 溶液Ⅰ(1mol/L山梨醇和 50mmol/L柠檬酸钠混合液，pH 5.8)将菌体重悬，并加入适量的 D9515崩溃酶和 L4025消解酶(703U/mg)处理细胞，28℃、100r/min酶解 10min后迅速拿出，4℃、2500r/min离心 10min，收集菌体；菌体用 2mL溶液Ⅰ重悬，4℃、2500r/min离心10min，弃上清液，重复1次；菌体用2mL 1mol/L山梨醇溶液重悬，4℃、2500r/min离心 10min，弃上清液，重复 1次；菌体用100µL 1mol/L山梨醇溶液混匀，并加入预冷的待转片段，冰浴放置 10min；将混合液加入已经预冷好的电转杯中，冰浴放置 10min；1500V、200Ω 条件下进行电转，电转完毕后将菌体用1mol/L山梨醇溶液洗出，30℃培养箱中修复培养2～4h；修复培养后将全部菌体涂布于 HCS双层平板(初筛平板)中，30℃培养箱中培养 2～3d即可见转化子；将初筛平板长出的单菌落点板到 YEPD潮霉素抗性平板(复筛平板)上，30℃培养箱中培养 2d即可见转化子．

1.4 出芽短梗霉生物量和葡萄糖含量的测定

取 10mL菌液，12000r/min离心 2min，弃上清液；菌体用纯净水洗涤2次，12000r/min离心2min，弃上清液；所得菌体用纯净水悬浮后，转入干净的平皿中，70℃烘干至质量恒定，计算出芽短梗霉的生物量．

采用高效液相色谱法测定发酵液中葡萄糖含量：色谱柱为 Aglient HPX-87H(300×7.8mm)，检测器为示差检测器(RID)，检测器温度55℃，柱温65℃，流动相为5mmol/L硫酸溶液，流量0.6mL/min，进样量10µL．

1.5 普鲁兰多糖产量的测定

取 10mL菌液，12000r/min离心 2min取上清液 5mL，加入 2倍体积的无水乙醇，4℃放置 12h，5000r/min离心 8min去上清液；沉淀出来的多糖再用无水乙醇清洗2次；70℃烘箱烘干至质量恒定，计算多糖产量．

1.6 酶活力测定

依据 McCleary等[8]的方法测定葡萄糖基转移酶活力．将适当稀释的待测样本(0.2mL)与预均衡的对硝基苯基α-D-吡喃葡萄糖苷(0.2mL，10mmol/L)置于 0.1mol/L乙酸钠缓冲液(pH 4.0)中，40℃处理5min．通过加入 Trizma碱(3.0mL，2.0%)的水溶液终止反应，测量 410nm 处的吸光度．酶活力用对硝基苯酚释放量(µmol/L)表示，并通过参考标准曲线计算(通过用不同浓度的对硝基苯酚测量溶液的A410值来测定标准曲线)．使用在 100℃加热 5min的样本和反应液的混合物作为对照．

根据 Dutra等[9]的方法测定 UDPG焦磷酸化酶活力．酶活力单位定义为在测定条件下在1min内催化 1.0µmol/L底物转化的酶量．使用在 100℃加热5min的样本和反应液的混合物作为对照．

根据Qian等[10]的方法测定磷酸葡萄糖变位酶活力．酶活力单位定义为在测定条件下在1min内催化1.0µmol/L底物转化的酶量．使用在 100℃加热5min的无细胞提取物的混合物作为对照．

1.7 重油含量的测定

取 20mL发酵液，加入等体积的氯仿-甲醇混合液(1∶1)，在 50mL离心管中来回颠倒混匀；然后将混合液在4℃、12000r/min离心10min，将上清液倒入分液漏斗，待分层后将下层含有重油的液体分出；将含有重油的液体经氮吹仪氮吹，去除有机溶剂；得到的重油用氯仿-甲醇溶液再反复处理 2次，用以纯化重油；重油烘干至质量恒定，计算重油含量．

1.8 普鲁兰多糖结构的测定

普鲁兰多糖的结构采用傅里叶红外光谱仪进行分析．将 10mg样品与 250mg溴化钾混合均匀，用制片机在高压条件下制成薄片，仪器扫描波长范围为400～4000cm-1．

1.9 mRNA水平的测定

mRNA水平的测定方法参见文献[7]．测定 apo基因用引物 APOs/APOa，测定 gltP基因用引物gltPa/gltPs．

2 结果与分析

2.1 apo和gltP对出芽短梗霉菌株生长性能的影响

通过 NCBI查询到出芽短梗霉包含两个载脂蛋白基因 apo和 gltP，分别构建了整合过表达 apo或gltP基因的菌株 OA21和 OG5，以及单敲 apo或者gltP基因的菌株 Δapo和 ΔgltP．重组菌株的生长情况和葡萄糖利用能力如图 2所示．敲除 apo或 gltP后，菌株生长受到抑制，生物量分别较亲本株减少了10.85%和16.84%，而整合过表达apo或gltP对生物量没有显著影响．敲除 apo或 gltP降低了菌株对葡萄糖的利用能力，发酵 7d消耗的葡萄糖分别较亲本株减少了 4.5%和 13.3%，而整合过表达 apo或 gltP增强了菌株的葡萄糖利用能力，发酵 6d后整合过表达apo或gltP基因的菌株已经将葡萄糖消耗殆尽．

图2 重组菌株生物量和葡萄糖利用能力同亲本株的比较Fig. 2 Comparison of the cell growth and glucose utilization ability

2.2 apo和gltP对普鲁兰多糖合成的影响

为了考察载脂蛋白基因apo和gltP与普鲁兰多糖合成的关系，对所得重组菌株的普鲁兰多糖合成能力进行了测定，如图3所示．整合过表达apo或gltP后，普鲁兰多糖产量分别较亲本株增加了 7.78%和15.23%．敲除apo或gltP抑制了普鲁兰多糖的合成，普鲁兰多糖产量分别较亲本株降低了 21.35%和35.07%．由此可知，相较于 apo基因，gltP基因对于普鲁兰多糖的合成更为重要．

2.3 普鲁兰多糖合成途径关键酶活力

为了深入探究apo和gltP与普鲁兰多糖合成的关系，对普鲁兰多糖合成途径中的3个关键酶的酶活力进行了测定，结果见表 2．由表 2可知：整合过表达 apo后，磷酸葡萄糖变位酶活力、UDPG焦磷酸化酶活力和葡萄糖基转移酶活力分别较亲本株增加了18.52%、16.60%和 15.79%．整合过表达 gltP后，磷酸葡萄糖变位酶活力、UDPG焦磷酸化酶活力和葡萄糖基转移酶活力分别较亲本株增加了 25.93%、30.23%和 36.84%．敲除apo或gltP后，磷酸葡萄糖变位酶活力、UDPG焦磷酸化酶活力和葡萄糖基转移酶活力均出现不同程度的降低．

图3 apo和gltP对普鲁兰多糖合成的影响Fig. 3 Effect of apo and gltP genes on the synthesis of pullulan

表2 重组菌株普鲁兰多糖合成途径关键酶活力Tab. 2 Enzyme activity of the key enzymes in the pullulan synthesis pathway

2.4 apo和gltP对以重油为代表的脂类物质合成的影响

载脂蛋白与脂类物质的合成密切相关．出芽短梗霉所产脂类的主要成分为重油[1]．为了考察载脂蛋白基因 apo和 gltP与脂类物质合成之间的关系，选取重油作为脂类物质的代表进行研究．出芽短梗霉分泌的重油是一种脂类物质，在医药、化工等行业有巨大的应用前景，apo和gltP对以重油为代表的脂类物质合成的影响如图4所示．由图4可知：整合过表达 apo或 gltP后，重油产量分别较亲本株增加了41.38%和3.5倍．敲除apo或gltP抑制了脂类物质的合成，重油产量分别较亲本株降低了 17.24%和28.74%．这些结果表明，apo和gltP都能影响出芽短梗霉对重油的合成，但是gltP基因的影响更显著．

图4 apo和gltP对重油合成的影响Fig. 4 Effect of apo and gltP genes on the synthesis of heavy oil

2.5 普鲁兰多糖结构鉴定

采用傅里叶红外光谱仪对重组菌株所产普鲁兰多糖结构进行了鉴定，并同普鲁兰多糖标品进行比对，结果如图 5所示．由图 5可知：所有样品均在755cm-1和 915cm-1处有吸收峰，这些特征峰证实了α-(1→4)和α-(1→6)糖苷键的存在，而这个键型结构是构成普鲁兰多糖最基本的结构．同普鲁兰多糖标品的红外光谱图比对发现，所有重组菌株与标品结构基本一致，确认了所产胞外多糖为普鲁兰多糖．

图5 重组菌株所产普鲁兰多糖与普鲁兰多糖标品红外光谱的比对Fig. 5 Comparison of the IR spectra of pullulan produced by the recombinant strains with that of the standard pullulan

2.6 获得的重组菌株apo和gltP基因相对表达量

对敲除或整合过表达 apo，以及敲除或整合过表达 gltP基因的菌株所对应基因的转录水平进行了检测，见图 6．从图 6中可知，敲除 apo或 gltP基因后apo或 gltP基因转录几乎检测不到，进一步证实了apo或gltP基因已经被敲除．整合过表达apo或gltP则显著增强了对应基因的转录水平，OA21菌株的apo转录水平较原始菌株增加了4.1倍，OG5菌株的gltP转录水平较原始菌株增加了3.9倍．

图6 重组菌株对应基因转录水平与亲本株的比较Fig. 6 Comparison of the transcription levels of the recombinant strains with parent strains

3 讨 论

普鲁兰多糖理化性能独特，在食品、化工、医药等行业应用广泛[1]．经文献汇总，本文绘制普鲁兰多糖合成途径(图7)．

图7 普鲁兰多糖合成途径Fig. 7 The proposed pullulan synthesis pathway

已有的文献报道部分印证了该合成途径，葡萄糖基转移酶、磷酸葡萄糖变位酶、UDPG焦磷酸化酶和普鲁兰合酶被认为是普鲁兰多糖合成途径中的关键酶[1,3-4]．除了上述关键酶外，脂类物质也同普鲁兰多糖合成密不可分．脂类物质与 UDPG的结合形成普鲁兰多糖合成的基本单元lipid-G[5]，而这是普鲁兰多糖合成所必须的．载脂蛋白负责调控脂类物质的生物合成[6]，那么载脂蛋白势必会影响普鲁兰多糖的合成．多位研究者[5-6,11]也认为胞外多糖的合成与脂类物质紧密相关．

为了确认脂类物质是否参与普鲁兰多糖的合成过程，本文考察了载脂蛋白基因 apo和 gltP对普鲁兰多糖合成的影响．载脂蛋白基因 apo和 gltP能够影响出芽短梗霉生长性能和葡萄糖利用能力．apo或者 gltP的敲除抑制了菌株的生长，这可能是由载脂蛋白对胞内多种细胞器膜的调控引起的[12]．敲除apo或者 gltP后菌株葡萄糖利用能力降低，这是由较慢的菌株生长和生成产物的减少引起的(图3和图4)．

载脂蛋白能调节脂类物质的合成和运输[13]．本文研究结果表明整合过表达apo或者gltP能够促进以重油为代表的脂类物质和普鲁兰多糖的合成，而敲除 apo或者 gltP则抑制了重油和普鲁兰多糖的生成．由此可知，适量增强出芽短梗霉脂类物质的合成有助于提高普鲁兰多糖产量，这与 Sutherland[11]和Simon等[6]的推测是相符合的．Price等[14]的研究表明，过度强化出芽短梗霉脂类物质的合成不利于普鲁兰多糖合成．研究结果还发现，虽然apo和gltP能够调控普鲁兰多糖的产量，但是并不引起普鲁兰多糖结构的改变．

通过测定重组菌株普鲁兰多糖合成途径中关键酶的酶活力，发现整合过表达 apo或者 gltP能够促进葡萄糖基转移酶、磷酸葡萄糖变位酶和 UDPG焦磷酸化酶的活力，而敲除 apo或者 gltP则降低了 3个关键酶的活性．葡萄糖基转移酶、磷酸葡萄糖变位酶和 UDPG焦磷酸化酶对普鲁兰多糖合成至关重要[1,3-4]，这3个关键酶活力的改变能直接影响普鲁兰多糖的合成．

重油是普鲁兰多糖所产脂类物质的主要成分．研究结果显示普鲁兰多糖产量和重油产量呈正相关，这预示着重油可能参与普鲁兰多糖合成所需基本单元糖脂中间体 lipid-G的生成．但是，并非重油合成能力越强普鲁兰多糖合成能力越强，比如 Price等[14]就发现过度强化的重油合成能力能够抑制普鲁兰多糖的生成．

apo和 gltP对出芽短梗霉普鲁兰多糖合成的调节作用可以从以下几点来解释．第一，apo和 gltP调控脂类物质的合成，进而影响普鲁兰多糖合成所需基本单元糖脂中间体 lipid-G的生成，最终改变普鲁兰多糖合成．第二，apo和 gltP表达量的改变引起了脂类物质含量的改变，某些脂类物质作为反式作用因子强化了 UDPG 的合成[15]，导致普鲁兰多糖合成途径中关键酶活力性的增加．第三，出芽短梗霉重油是一种表面活性剂[16]，重油合成的增强有助于改善出芽短梗霉细胞膜通透性[17]，有利于普鲁兰多糖的外泌．

综上，本文研究结果表明载脂蛋白基因 apo和gltP能够调节出芽短梗霉普鲁兰多糖的合成，并且gltP对普鲁兰多糖合成的影响大于 apo．gltP和 apo都负责介导脂类物质的转运，但 gltP主要负责脂类物质向胞外转运[7]，而 apo负责胞内转运[18]，不同的分工导致了这两个基因对于脂类物质合成的作用相区别．

4 结 语

本文研究结果显示，整合过表达 apo或 gltP能使普鲁兰多糖产量分别增加 7.78%和 15.23%，而分别敲除apo或gltP则使普鲁兰多糖产量降低21.35%和 35.07%；证实了脂类物质和普鲁兰多糖合成紧密相关，丰富和完善了普鲁兰多糖合成途径，为增加普鲁兰多糖合成基本单元糖脂中间体lipid-G的来源提供了新的思路．