黄芪甲苷含量测定研究进展

王继明，陈丽娜，杜芳，韩国庆，王耀新

(内蒙古蒙肽生物工程有限公司研究院，内蒙古 呼和浩特 010051)

黄芪为豆科植物蒙古黄芪或膜荚黄芪干燥的根[1]。黄芪主要含有多糖、黄酮类化合物及三萜皂苷[2]，其中黄芪的主要活性成分为黄芪皂苷。黄芪甲苷为黄芪皂苷的主要成分，黄芪甲苷具有抗炎、抗肝纤维化、抗氧化、抗哮喘、降血糖、免疫调节和心肌保护等多重功效[3]。因此黄芪在医药和保健食品方面具有十分广泛的应用。同时黄芪甲苷成为含有黄芪的医药和保健食品的质量控制指标之一。《中国药典》2015年版[1]收录了黄芪甲苷做为黄芪的质量控制指标。由于黄芪中含有多糖、黄酮、皂苷、氨基酸、色素等多种成分，为了使其他成分不对黄芪甲苷的含量测定产生影响，在对样品中黄芪甲苷的含量测定前，需对样品进行预处理。黄芪甲苷含量的测定方法有比色法、荧光法、薄层扫描法、高效液相色谱法、超高效液相色谱法和近红外漫反射光谱法等，其中高效液相色谱法为近年来广泛应用的方法。下面分别对样品的预处理和黄芪甲苷含量测定的方法进行综述。

1 样品的预处理

图1 黄芪甲苷含量测定预处理过程

样品用甲醇提取，将样品中的黄芪甲苷等成分溶解到甲醇中，用甲醇做为溶剂进行提取，常见的有回流提取和超声提取2种方式。甲醇提取液脱除甲醇后用水溶解残留固体，用乙醚或石油醚洗涤去除水溶液中的脂溶性杂质，用水饱和的正丁醇萃取，除去水溶液中的水溶性杂质，碱溶液洗涤去除酸性杂质，碱溶液一般为氨试液、1%氢氧化钠或1%氢氧化钾。用大孔吸附树脂对样品进一步纯化，所用大孔吸附树脂有D101型和DM-301型。对于大多数样品的预处理均省略了乙醚或石油醚洗涤、大孔吸附树脂处理步骤，黄芪甲苷含量的测定满足方法学的要求。同时根据样品的性质决定是否省略甲醇提取步骤。

图1中省略乙醚或石油醚洗涤步骤，大孔吸附树脂为D101型即为《中国药典》2015年版[1]黄芪中黄芪甲苷含量测定的预处理方法。2013年丁如贤等人[4]报道了对黄芪供试品的处理中省去大孔吸附树脂除杂步骤对黄芪甲苷峰的分离及检测没有任何影响。2011年刘浩文等人[5]比较了中国药典和香港中药材标准黄芪中黄芪甲苷含量测定方法。香港中药材标准方法的重现性良好，结果准确可靠，且样品前处理方法简便，测得黄芪药材中黄芪甲苷含量与中国药典相比没有统计学差异。香港中药材标准黄芪中黄芪甲苷含量测定供试品溶液制备流程见图2。

图2 香港中药材标准黄芪中黄芪甲苷含量测定供试品溶液制备流程

2006年朱蕾[6]报道了将保健食品用甲醇超声提取、水饱和正丁醇萃取、1%氢氧化钾洗涤、DM-301大孔吸附树脂处理，所得的洗脱液又经过了Oasis HLB 3cc型固相萃取柱除去样品中极性大于和小于黄芪甲苷的物质，并对其进行了富集，以达到仪器测定的灵敏度。

样品预处理的目的是通过预处理步骤将样品中的黄芪甲苷进行纯化以满足后续样品测定的要求，根据样品的性质，在满足样品测定需求的条件下，可以将样品预处理过程简化，节省样品预处理时间，进而提高样品检测效率。

2 黄芪甲苷含量测定

2.1 比色法

比色法是通过黄芪甲苷与显色剂发生显色反应后生成有色物质，再用分光光度计测定吸光度，有色物质浓度与吸光度成正比，根据样品的吸光度值计算样品中黄芪甲苷的含量。2004年李永吉等人[7]利用香草醛-高氯酸比色法测定了复方黄芪注射液中总皂苷含量。复方黄芪注射液经水饱和正丁醇萃取、1%氢氧化钠溶液洗涤、正丁醇饱和的水洗涤、溶剂脱除和甲醇溶解步骤得到供试品溶液。取供试品溶液脱除甲醇，依次加入5%香草醛冰醋酸溶液和高氯酸，70℃水浴加热20 min，冷却后加入冰醋酸，于540 nm处测定吸光度。该方法的精密度、重现性和稳定性的RSD分别为1.5%、1.0%和0.34%。黄芪甲苷在8.33～41.67 μg/mL浓度范围内线性良好(r=0.999 7)，回收率为100.64%。

2016年卢伟等人[8]将黄芪经甲醇回流提取、水饱和正丁醇萃取、氨试液洗涤、溶剂脱除和甲醇溶解步骤得到了供试品溶液。向供试品溶液中依次加入5%亚硝酸钠、10%硝酸铝溶液和4%氢氧化钠溶液，每加一种溶液放置一段时间，然后在367 nm处测定吸光度。该方法的精密度、重现性和稳定性的RSD分别为1.9%、1.72%和1.81%，加标回收率为99.5%，黄芪甲苷在进样量0～0.04 mg/mL范围内线性较好(r=0.959 5)。

由于黄芪中含有多种三萜皂苷，黄芪甲苷为其中的一种，其他三萜皂苷也可能会与显色剂发生相同的显色反应，因此利用比色法可以测定总皂苷的含量，对于黄芪甲苷含量的测定较为困难。

2.2 荧光法

荧光法是利用黄芪甲苷与某些试剂反应生成在紫外光照射后能发射荧光的物质特性而定量分析的方法。2010年杨连梅等人[9]利用大茴香酸在硫酸介质中与黄芪甲苷反应产生强烈荧光的特性测定黄芪中黄芪甲苷含量，黄芪甲苷反应物最大激发波长为320 nm，最大发射波长为387 nm。该方法的精密度、重现性和稳定性的RSD分别为0.10%、1.41%和2.15%，加标回收率为97.22%，黄芪甲苷在1.0～8.0 μg/mL浓度范围内线性良好(r=0.999 7)。

与比色法相同，荧光法适合于测定一类物质的含量，对于黄芪甲苷单组分含量的测定较为困难，需要通过繁琐的预处理步骤以消除其他成分的影响。同时黄芪中三萜皂苷类物质的结构较为相似，分离难度较大。

2.3 薄层扫描法

薄层扫描法被2000年版《中国药典》收载为黄芪中黄芪甲苷含量的测定方法。薄层扫描法的薄层板一般采用硅胶G，展开剂为氯仿-甲醇-水，显色剂为10%硫酸乙醇溶液。2006年刘丰丰等人[10]用薄层扫描法测定了黄芪颗粒中黄芪甲苷含量。采用硅胶G薄层板，点状点样，展开剂为氯仿-甲醇-水(13∶6∶2)10℃以下放置过夜的下层液，展开晾干后，用10%硫酸乙醇溶液在105℃条件下加热至斑点显色清晰。用反射法双波长锯齿扫描，检测波长和参比波长分别为530 nm和700 nm。该方法同板精密度和异板精密度的RSD分别为2.03%和2.31%，重复性的RSD为2.33%，加样回收率为98.72%，黄芪甲苷在进样量为1.012～8.096 μg范围内线性良好(r=0.997)。2007年肖辛垣等人[11]报道了用薄层扫描法测定健儿涂膜剂中黄芪甲苷含量。采用硅胶G薄层板，展开剂为氯仿-乙酸乙酯-甲醇-水(20∶40∶22∶10)10℃以下放置12h的下层溶液，10%硫酸乙醇溶液为显色剂，双波长反射法锯齿扫描，检测波长和参比波长分别为530 nm和700 nm。该方法同板精密度和异板精密度的RSD分别为1.66%和2.80%，重复性的RSD为2.35%，稳定性的RSD为1.01%，加样回收率为96.56%，黄芪甲苷在进样量为0.5～2.5 μg范围内线性良好(r=0.999 7)。2015年Jing Zhang等人[12]用高效薄层色谱同时测定了黄芪中的黄芪甲苷和芒柄花黄素。将黄芪干燥的根粉碎，置于索氏提取器中用石油醚脱脂，脱脂后将残渣用甲醇回流提取，脱除甲醇，用水溶解残渣，用水饱和的正丁醇提取，氨试液洗涤，将正丁醇相蒸发至干，用甲醇溶解得到供试品溶液。采用硅胶H薄层板，石油醚-水饱和正丁醇-冰乙酸(3.5∶2∶4)为展开剂，显色剂为10%硫酸乙醇溶液，在254 nm处扫描。进行了方法学验证，具体情况见表1。

通过薄层色谱能够将黄芪甲苷与其他成分进行分离，可以用于黄芪甲苷含量的测定，但是薄层扫描法测定过程需要进行样品预处理、展开、显色和扫描等步骤，处理过程较为繁琐，样品测定效率相对较低。

表1 HPTLC法测定黄芪中黄芪甲苷和芒柄花黄素方法学研究

2.4 高效液相色谱法

高效液相色谱法具有分离度和灵敏度高及适用范围广等优点广泛应用于黄芪甲苷的含量测定。在黄芪甲苷的含量测定中所用的检测器有：紫外检测器(UVD)、蒸发光散射检测器(ELSD)、质谱检测器(MSD)、电喷雾检测器(CAD)和脉冲安培检测器(PAD)。下面分别进行论述。

2.4.1 HPLC-UV法

黄芪甲苷的甲醇溶液最大紫外吸收波长为200.8 nm。可通过紫外检测器进行测定，紫外检测器是高效液相色谱中较为常用的检测器。2014年，姜丽丽等人[13]用HPLC-UV法测定了黄芪干燥根中黄芪甲苷的含量。色谱柱为Kromail C18柱，流动相为乙腈-水(32∶68)，流速为1.0 mL/min，检测波长为203 nm。该方法精密度、稳定性和重复性的RSD分别为0.48%、2.87%和2.93%，回收率为98.22%，黄芪甲苷在0.05～0.50 mg/L浓度范围内线性良好(r=0.999 7)。

由于黄芪甲苷的最大紫外吸收波长在200 nm左右，在此波长处许多杂质和溶剂有吸收，对黄芪甲苷的含量测定造成干扰。为了提高黄芪甲苷测定的灵敏度和专一性，将黄芪甲苷进行衍生化，向黄芪甲苷分子结构中引入共轭系统，使紫外吸收发生红移。2000年Meicun Yao等人[14]开发了反相高效液相色谱测定黄芪甲苷含量的方法。采用了柱前衍生化方法，用苯甲酰氯与黄芪甲苷定量反应生成黄芪甲苷苯甲酰酯，色谱柱为Spherisorb ODS C18柱，流动相为90%甲醇-4%四氢呋喃-6%水-0.2%三乙胺，流速为0.8 mL/min，检测波长为230 nm。用维生素D3做为内标物，对衍生化反应条件进行了优化，同时进行了方法学研究，黄芪甲苷在0.004～0.080 mg/mL浓度范围内线性关系良好，回收率为94.7%，检测限为0.002 mg/mL。2006年朱蕾[6]也对黄芪甲苷的衍生化反应进行了研究，采用正交试验设计对反应时间、反应温度、吡啶用量和苯甲酰氯用量条件进行了优化，确定了最佳的衍生化反应条件。2012年侯素云等人[15]比较了HPLC-ELSD内标法(人参皂苷Rb2做为内标物)和柱前衍生化法(用苯甲酰氯进行衍生化)测定黄芪甲苷含量的优劣，实验结果表明，柱前衍生化法测定结果的精密度、重复性、稳定性和准确度均优于HPLC-ELSD内标法。但是柱前衍生化法对样品的预处理时间较长，样品含量测定的周期较长。

2.4.2 HPLC-ELSD法

蒸发光散射检测原理是流动相溶剂喷雾气化，进入加热管后溶剂挥发，留下被分析检测的物质颗粒，被分析的物质颗粒经镭射光产生散射，散射光由光电倍增管收集得到响应，光散射检测器的响应大小由被分析物质颗粒的数量和大小决定，不受流动相溶剂的干扰，不要求被测组分有特定的化学结构。特别适合于黄芪甲苷这种紫外末端吸收，没有特定吸收波长的情况，故被2015年版《中国药典》[1]收载为黄芪中黄芪甲苷含量测定的方法。

2001年[16]Wenkui Li等人用HPLC-ELSD法测定了黄芪中黄芪甲苷含量，色谱柱为Zorbax Eclipse XDB C18柱，用乙腈和水进行梯度洗脱，流速为1.6 mL/min，柱温为20℃，蒸发温度为43℃，气体压力为3.4 bar。黄芪甲苷的检测限为40 ng，平均回收率为95.8%。该方法为测定黄芪甲苷含量的主要方法。表2中列出了2015—2017年用HPLC-ELSD法测定黄芪甲苷含量的相关研究。

与紫外检测器相比，蒸发光散射检测器不需要进行衍生化反应，适用于没有紫外吸收的物质。缩短了样品的测定周期。

2.4.3 HPLC-MS法

质谱分析具有灵敏度高、选择性强、准确性好等特点。高效液相色谱与质谱联用可以分析复杂成分样品和微量物质，为复杂样品中黄芪甲苷的含量测定提供了方法。2017年李光河[29]用液相色谱-质谱法测定了丹溪玉屏风颗粒中黄芪甲苷含量，色谱柱为Agilent SB-C18柱，流动相为甲醇-0.1%甲酸水溶液(70∶30)，流速为0.4 mL/min，柱温为30℃。质谱条件为：电喷雾正离子模式检测，黄芪甲苷选择离子对为627.4-807.2，雾化器压力为35 psi，干燥气流速为8.0 L/min，干燥气温度为450℃，毛细管电压为4 000 V，四级杆温度为100℃。研究结果表明，该方法精密度、重复性和稳定性(8 h)的RSD分别为2.7%、2.0%和2.8%，加样回收率为99.42%，黄芪甲苷在5.1～76.5 ng/mL浓度范围内呈良好的线性关系(r=0.999 4)。

2.4.4 HPLC-CAD法

蒸发光散射检测器和电喷雾检测器都属于气溶胶型检测器，电喷雾检测器是在2004年推出的一种较为新型的通用检测器，其响应值不依赖于被测物质的光学性质和离子化效率，能检测非挥发或半挥发性物质。与蒸发光散射检测器相比，电喷雾检测器的检出限更低，灵敏度更高。2012年刘兴国等人[30]比较了质量型检测器ELSD和CAD用于测定黄芪甲苷的优劣。ELSD和CAD都能够准确可靠地进行黄芪甲苷含量的测定，但是CAD的检出限和定量限要比ELSD低得多。CAD在灵敏度和重现性方面均要好于ELSD。2014年李效宽等人[31]利用在线固相萃取法结合电喷雾式检测器测定了黄芪甲苷的含量。用Acclaim PA2净化柱对样品纯化。样品分析柱为Acclaim C18，乙腈-水(35:65)为流动相，流速为1.0 mL/min，柱温为35℃。电喷雾检测器的雾化温度为30℃，氮气压力为241.3 kPa。黄芪甲苷的定量限为0.66 mg/L，检出限为0.33 mg/L。黄芪甲苷在4.0～80 mg/L浓度范围内线性关系良好(r=0.999 8)。2016年梁慧敏等人[32]用高效液相色谱-电喷雾检测器法测定了贞芪扶正颗粒中黄芪甲苷含量。色谱柱为ZORBAX Eclipse Plus C18柱，乙腈-水(32∶68)为流动相，流速为1.0 mL/min。电喷雾检测器雾化温度为35℃，载气氮气压力为63.6 psi。该方法精密度、重复性和稳定性的RSD分别为1.1%、1.5%和1.1%。加样回收率为99.14%，黄芪甲苷在进样量为0.286～2.86 μg范围内线性良好(r=0.999 8)。

表2 HPLC-ELSD法测定黄芪甲苷含量文献汇总(2015—2017年)

2.4.5 HPLC-PAD法

脉冲安培检测器出现在20世纪80年代初，是美国Dionex公司为满足糖的测定而研制[33]。在较高pH溶液中，糖可在金电极上被氧化，因此可用电化学法进行检测。由于金电极吸附待测成分的氧化产物以及金电极表面形成氧化层，使得金电极会很快失效。为了解决这一问题，由三个不同的脉冲电位代替加于工作电极上的恒定电位。用较工作电位高的正电位除去金电极上被测成分的氧化产物。同时再加一个大的负电位，使金电极部分被氧化成的氧化金还原到还原状态。黄芪甲苷中含有糖的部分，因此可用脉冲安培检测器进行黄芪甲苷的检测。2012年Ha-Jeong Kwon等人[34]用HPLC-PAD法测定了黄芪中的黄芪皂苷含量。脉冲安培检测系统包括金工作电极和Ag/AgCl参比电极。电位波形为：E1=-0.2 V(0.00-0.004 s)，E2=0 V(0.05-0.21 s)，E3=+0.22 V(0.22-0.46 s)，E4=0 V(0.47-0.56 s)，E5=-2V(0.57-0.58 s)，E6=+0.6V(0.59 s)。以洋地黄毒苷做为内标物，以黄芪甲苷与内标物峰面积比和黄芪甲苷浓度进行线性回归，线性范围为0.000 6～0.4 μg,r2=1.000 0。黄芪甲苷的检测限和定量限分别为0.2 ng和0.6 ng。黄芪甲苷加入量为0.10 mg，回收率为(91.33±3.69)%，黄芪甲苷加入量为1.00 mg，回收率为(96.19±1.68)%。

2.5 超高效液相色谱法

与高效液相色谱相比，超高效液相色谱法的检测速度较快，灵敏度和分离度较高。2015年Li Wang等人[35]使用超高效液相色谱-四极轨道阱质谱测定了保健酒中黄芪甲苷含量。色谱柱为Hypersil GOLD C18，用0.1%甲酸水溶液和0.1%甲酸甲醇溶液梯度洗脱，流速为0.2 mL/min，柱温为35℃。Q Exactive MS系统由四极质谱和轨道阱质谱组成。电喷雾正离子模式检测，检测m/z807.45→m/z627.39离子跃迁，离子源电压为3200 V，温度为350℃。黄芪甲苷的定量限和检测限分别为0.5和0.25 ng/mL，回收率为92.5%～96.7%，线性范围为1.8～36 ng/mL，回归系数为0.999 9。超高效液相色谱-四极轨道阱质谱具有分析速度快、高的灵敏度和选择性的优点。2016年华云鹏等人[36]用UPLC-MS法测定了安喘舒丸中的黄芪甲苷含量。色谱柱为Agilent ZOBAX SB C18色谱柱，甲醇-0.1%甲酸水溶液(25∶75)为流动相，流速为0.2 mL/min，柱温为35℃。电喷雾正离子模式检测，毛细管电压为4 000 V，干燥气温度为400℃，检测对象为m/z808.2→m/z628.5。黄芪甲苷的定量限为5 ng/mL，精密度、稳定性和重复性的RSD分别为2.7%、2.4%和3.4%，加样回收率为97.20%。

2.6 其他方法

2012年Li Gu等人[37]报道了使用茜素红做为电流指示器，基于硼酸功能化的多壁碳纳米管的新型电化学传感器用于黄芪甲苷含量的测定。2017年战皓等人[38]采用近红外漫反射光谱法对黄芪中毛蕊异黄酮葡萄糖苷和黄芪甲苷的含量进行了测定。

3 结语

黄芪甲苷做为黄芪类药物和保健食品的标志性成分，其含量的测定方法主要有比色法、荧光法、薄层扫描法和液相色谱法等。比色法和荧光法的操作简单、成本低廉，可用于黄芪总皂苷含量的测定。薄层扫描法设备简单，操作方便，但预处理复杂，在早期的黄芪甲苷含量测定应用较多。高效液相色谱法中使用的检测器有：紫外检测器(UVD)、蒸发光散射检测器(ELSD)、质谱检测器(MSD)、电喷雾检测器(CAD)、脉冲安培检测器(PAD)。使用紫外检测器直接测定干扰较为严重，将样品进行衍生化处理后可用紫外检测器进行检测，但样品的前处理复杂，测定样品所需时间较长。蒸发光散射检测器具有灵敏度高、受干扰因素少等特点，目前黄芪甲苷含量的测定多用该检测器。电喷雾检测器在灵敏度和重现性方面均要好于ELSD，是今后推广应用的方向。质谱检测器和脉冲安培检测器更适合于黄芪甲苷的微量分析。超高效液相色谱与质谱联用技术也用于黄芪甲苷的含量测定，该方法与高效液相色谱相比，具有检测速度较快，灵敏度和分离度高等特点，是今后黄芪甲苷含量测定的发展方向。