滋水清肝理冲饮对EMs小鼠应用GnRHa后体质量和旷场行为的影响

马小娜，李冰冰，闫军堂，任国辉，郭亚楠， 谢苗，和翔宇，刘雁峰*

(1.北京中医药大学第三附属医院，北京 100029；2.北京中医药大学东直门医院，北京 100700； 3.北京中医药大学，北京 100029；4.河南洛阳66069部队医院，河南 洛阳 471000 )

子宫内膜异位症(endometriosis，EMs)是指有生长功能的子宫内膜组织出现在子宫腔被覆黏膜以外的身体其他部位而引起的病证[1]。它的发病率逐年增高，是不孕、痛经的重要原因，严重危害女性健康。在诊断为子宫内膜异位症的患者中，不孕的发生率约为30%～50%，而自然流产的发生率亦有约40%。痛经的妇女中有40%～60%是此病所致[2]。这严重影响了育龄期女性的生活。目前GnRHa已成为治疗EMs的一线药物，但GnRHa引起的低雌激素症状如失眠、乏力、潮热出汗、阴道干涩不适、关节痛、性欲下降、精神抑郁等类围绝经期症状及骨质丢失限制了该药物的长期使用，因其带来的明显不良反应严重影响患者生活质量及治疗依从性。本实验主要观察研究滋水清肝理冲饮对EMs小鼠应用GnRHa后体质量和旷场行为的影响，探讨滋水清肝理冲饮对EMs小鼠应用GnRHa所致体质量下降及活动度降低的改善作用，从而为中医药干预治疗EMs应用GnRHa后的不良反应提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

选择SPF级6～8周龄雌性BALB/c小鼠78只，体质量18～22 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证编号：SCXK-(军)2012-0004。饲养于北京中医药大学动物实验室，温度控制20～25℃，相对湿度40%～60%，清洁度Ⅱ级。实验方案经北京中医药大学动物伦理委员会审核批准。

1.2 动物分组

将BALB/c小鼠78只小鼠随机分为捐赠鼠20只，实验鼠58只，再将58只实验鼠随机分为正常组8只，疾病模型组、GnRHa组、中药高剂量组、中药中剂量组、中药低剂量组各10只。

1.3 试剂

补佳乐(戊酸雌二醇片)，0.9%氯化钠溶液，水合氯醛，碘伏，苏木素染液，伊红染液，4%多聚甲醛。

1.4 药物

滋水清肝理冲饮配方颗粒组成：由北京康仁堂药业有限公司提供，药物组成：熟地黄15 g，山药15 g，山茱萸10 g，牡丹皮6 g，茯苓10 g，丹参15 g，制鳖甲20 g，白芍12 g，炒栀子10 g，酸枣仁15 g，郁金10 g，合欢皮10 g，莲子心3 g。

注射用醋酸亮丙瑞林缓释微球，3.75 mg，批准文号：国药准字H20093809，生产厂家：北京博恩特药业有限公司。

1.5 模型建立

小鼠造模前5天以补佳乐0.15 mg/kg灌胃，连续灌胃5 d；颈椎脱臼法处死供体小鼠，仰卧位固定于手术台，碘伏消毒腹部皮肤，铺巾，沿腹部正中线剖开腹腔，取出子宫，立即置入装有生理盐水的培养皿中, 剔除子宫周围的脂肪组织，漂洗干净；沿Y型子宫正中线剪开，将子宫均分为左右两半，分别放入含有1 mL生理盐水的培养皿中，用眼科剪将子宫纵行剖开，暴露出子宫内膜面，然后剪碎呈约1 mm大小的小碎块；消毒受体小鼠腹部后，于下腹部偏腹中线0.5 cm处的左下腹为进针点,将含有子宫内膜碎片的1 mL生理盐水混匀，用16号针头注射器注入受体小鼠的腹腔；手术全程为无菌条件，全程操作控制在5 min内完成；造模后连续以补佳乐0.15 mg/kg灌胃3 d。

1.6 子宫内膜异位症模型小鼠评价

造模后21天除外空白组，其余各组随机挑选2只子宫内膜异位症模型小鼠开腹观察异位病灶情况。5%水合氯醛(6 mL/kg)腹腔麻醉，碘伏消毒腹部皮肤，铺巾，沿腹部正中线剖开腹腔，逐层打开腹腔，观察盆腹腔内异位灶位置、形态、大小、数目、质地和其与周围组织的关系等情况。

1.7 给药方法

除外正常组和疾病模型组外，其余各组在造模21 d后开始给予GnRHa皮下注射，共1次。在给予GnRHa皮下注射日当天，中药高剂量组、中药中剂量组、中药低剂量组同时开始给予中药灌胃(剂量分别为48 g/kg、24 g/kg、12 g/kg)连续给药30 d；正常组、疾病模型组和GnRHa组给予相同体积的生理盐水灌胃，连续30 d。

1.8 观察指标及检测方法

在给药结束后第一天进行小鼠体质量测定和旷场实验。比较各组间差异。

旷场实验：制备小鼠旷场反应箱(40 cm×40 cm×38 cm)，内壁涂黑，底面平均划分25个小格。选取安静场地，将小鼠放入反应箱中央，摄像系统记录动物在旷场内5 min的行为学表现，记录小鼠走出第一格的潜伏期、跨越方格总数和周边时间(花在周边12个方格总时间)、站立次数(双腿离地)和大便颗粒数。两只动物之间用75%酒精擦拭底部及四壁，以免“前任者效应”。

2 结果

2.1 子宫内膜异位症模型小鼠评价

造模后第21天开腹观察，经大体观察和组织病理学分析，造模成功率为100%。 异位病灶多位于小鼠左盆腹腔，还有异位于膀胱旁、肠系膜旁，成单个或多房葡萄样，多呈透明样，异位病灶表面和周围可见细小血管(见图1)。取异位病灶，石蜡包埋切片，经HE染色镜下可见(见图2)，异位病灶囊壁由上皮细胞层、间质层、肌肉层和外周的浆膜层组成，可见腺体，内膜上皮细胞呈矮柱状或立方状，可见炎性细胞浸润。

注：箭头所指处为异位病灶图1 异位病灶大体观察

2.2 体质量

用药前后各实验组小鼠体质量评分的比较

中药治疗前：治疗前各组小鼠之间体质量无明显差异(P>0.05)。

中药治疗后：与正常组相比较，GnRHa组体质量明显减轻，琥珀散低、中剂量组体质量明显增加，差异有统计学意义(P<0.01)，琥珀散高剂量组与疾病模型组较正常组相比，差异无统计学意义(P>0.05)；与疾病模型组相比较，GnRHa组体质量明显减轻，琥珀散低、中剂量组体质量增加，差异有统计学意义(P<0.01或P<0.05)，琥珀散高剂量组较疾病模型组相比，差异无统计学意义(P>0.05)；与GnRHa组相比较，琥珀散各剂量组体质量明显增加，差异有统计学意义(P<0.01)；琥珀散各剂量组之间差异无统计学意义(P>0.05)。

中药治疗前后同组间体质量比较： 正常组与疾病模型组中药治疗前后体质量无明显变化，差异无统计学意义(P>0.05)；GnRHa组中药治疗后较中药治疗前体质量明显减少，差异有统计学意义(P<0.01)；中药各剂量组中药治疗后较中药治疗前体质量增加，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 各组小鼠中药治疗前后体质量评分比较

注：与正常组相比较，**P<0.01；与疾病模型组相比较，#P<0.05，##P<0.01；与GnRHa组相比较，△△P<0.01

2.3 旷场实验评分

2.3.1 各组小鼠潜伏期、跨越方格数、站立次数、周边站立时间评分的比较

与正常组相比较：GnRHa组潜伏期时间明显延长,跨越方格数、站立次数、周边站立时间明显减少，差异有统计学意义(P<0.01或P<0.05)；疾病模型组站立次数明显减少,周边站立时间缩短,差异有统计学意义(P<0.05)；疾病模型组潜伏期及跨越方格数差异无统计学意义(P>0.05)；滋水清肝理冲饮各剂量组潜伏期、跨越方格数、站立次数和周边站立时间差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

与疾病模型组相比较：GnRHa组潜伏期时间延长，跨越方格数减少，差异有统计学意义(P<0.05)，站立次数及周边站立时间差异无统计学意义(P>0.05)；滋水清肝理冲饮各剂量组周边站立时间延长，差异有统计学意义(P<0.05)；潜伏期、跨越方格总数、站立次数差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 各组小鼠潜伏期、跨越方格数、站立次数、周边站立时间评分比较

注：与正常组相比较，*P<0.05，**P<0.01；与疾病模型组相比较，#P<0.05；与GnRHa组相比较，△△P<0.01

与GnRHa组相比较，滋水清肝理冲饮各剂量组潜伏期时间明显缩短，跨越方格数及站立次数明显增加，周边时间明显延长，差异有统计学意义(P<0.01)。中药各剂量组之间差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

2.3.2 各组小鼠大便颗粒数的比较

与正常组相比较：GnRHa组及疾病模型组，差异有统计学意义(P<0.01)，滋水清肝理冲饮各剂量组，差异无统计学意义(P>0.05)；与疾病模型组相比较：GnRHa组大便颗粒数明显增加，滋水清肝理冲饮各剂量组大便颗粒数减少，差异有有统计学意义(P<0.01)；与GnRHa组相比较：滋水清肝理冲饮各剂量组大便颗粒数明显较少，差异有统计学意义(P<0.01)；滋水清肝理冲饮各剂量组之间差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3 各组小鼠大便颗粒数比较

注：与正常组相比较，**P<0.01；与疾病模型组相比较，##P<0.01；与GnRHa组相比较，△△P<0.01

3 讨论

EMs是一种性激素依赖性疾病，大量研究表明，GnRHa的使用可使得性激素水平严重降低，成开花等[3]研究发现，使用GnRHa类药物醋酸亮丙瑞林注射液进行治疗，在治疗4周时，血清FSH、LH、E2、P水平明显下降，12周较4周时无明显变化，一直在绝经期水平上下波动，而停药后2个月复查，上述激素均恢复至治疗前水平。目前GnRHa已广泛应用于雌激素依赖性疾病如子宫内膜异位症手术前、手术后的补充治疗，改善疾病相关症状并抑制子宫内膜异位症的复发。但应用GnRHa 所致的类围绝经期症状严重影响了患者的生活质量。Kim等[4]调查了GnRHa 治疗EMs的不良反应，主要是低雌激素证候群，表现为血管运动症状及骨质流失。雌激素的降低可影响骨代谢，增加骨吸收速度，因此，低雌激素状态容易引起骨质疏松。1993年Leather等[5]提出“反向添加疗法”，即在应用GnRHa时，添加少量雌激素，可减轻单用GnRHa所引起的不良反应。

研究人员在努力寻找性激素替代物中，发现植物雌激素可减轻围绝经期症状，又无雌激素的副作用。中药的植物雌激素作用可作为性激素替代治疗的新选择。滋水清肝理冲饮为北京中医药大学东直门医院刘雁峰教授经验方，该方在《医宗己任编》滋水清肝饮的基础上加减而成。滋水清肝饮为六味地黄丸合丹栀逍遥散化裁而来，现代研究认为，六味地黄丸和丹栀逍遥散均具有植物雌激素作用。六味地黄丸具有抗去势大鼠骨质疏松的作用[6]，丹栀逍遥散则具有温和的雌激素样活性[7]，逍遥散中的3种成分槲皮素、山奈酚和异鼠李素促进MCF-7的增殖，显著增加ERα和ERβ蛋白和mRNA 的表达，这些作用均由ER介导[8]。滋水清肝理冲饮以熟地黄、山药、山茱萸滋补肝肾之阴为君药，将柴胡换成郁金、合欢皮与炒栀子共为臣药，理气清心除烦，并佐以丹参、牡丹皮养血活血，制鳖甲、莲子心等滋阴清心共为佐使药。该方源于古方又别于古方，合于古法又寓有新意，组方合理、配伍精妙，可通过滋补肝肾、清热化瘀、解郁除烦以达到有效改善应用GnRHa所致围绝经期症状。

本实验选择体质量、旷场实验等来探索各组小鼠的行为学。旷场实验中，小鼠进入敞箱后，其对新异环境、噪声的恐惧从而使得活动次数减少，但动物的探究特性又会促使其运动。旷场实验通过观察小鼠在新异环境中的自主行为、探究行为与紧张度，从而反映出小鼠的焦虑水平[9]。通常情况下，旷场试验的水平活动得分反映动物的活动水平，垂直活动得分反映动物对新鲜事物的好奇程度，即兴趣的高低；其中跨格次数反映了动物的活动度,竖起次数反映了动物对新鲜环境的好奇程度,而焦虑动物的跨格次数、竖起或修饰次数减少。本实验结果显示，应用GnRHa注射后的EMs小鼠即GnRHa组小鼠较疾病模型组小鼠体质量减轻，活动度降低，主要表现为潜伏期时间延长、跨越方格数减少、大便颗粒数明显增加，其探索行为减少。中药滋水清肝理冲饮干预治疗后与GnRHa组相比较，潜伏期时间明显缩短，跨越方格数及站立次数明显增加，周边时间明显延长，差异有统计学意义，明显改善GnRHa注射后EMs小鼠的体质量减轻，活动度降低，对新鲜事物的好奇程度降低。

综上所述，我们通过腹腔注射法建立EMs小鼠模型的基础上，给予GnRHa皮下注射，通过旷场实验和体质量的测定，证明中药滋水清肝理冲饮在改善EMs小鼠应用GnRHa后的质量下降、活动度降低、对新鲜事物的好奇程度降低等方面表现出较好的临床优势。旷场实验是一个研究动物自发活动与探索行为的实验，可用于评价动物自发活动以及焦虑状态[10],由此可推断中药滋水清肝理冲饮可能改善小鼠焦虑抑郁状态，但具体的作用机制有待进一步的探索研究。