疮灵液对鼠永生化黑素细胞黑素生成的影响

周潋，彭皖苏，周梦圆，蒋佳风,徐萍,谭城*

(1.南京中医药大学，江苏 南京 210029；2.南京中医药大学第一附属医院 江苏省中医院，江苏 南京 210029)

白癜风是一种易诊难疗的色素减退疾病，自古以来，世界各个国家运用不同性质和效果的草药提取物治疗色素性疾病：银杏叶提取物、甜瓜、阿米芹种子提取物凯林、阿育吠陀医学中胡黄连、水龙骨提取物(青莲提取物)、绿茶多酚、辣椒素、姜黄色素、橙色喇叭花以及传统中医中药[1]。随着社会进步和信息化的发展，传统中医中药治疗已经走出国门，被全世界认可和接受:通过结合局部或全身UVA光照与补骨脂种子提取物联合运用的治疗方法(PUVA疗法)其作用机制及其疗效已被国际社会认可[1]。不仅仅是单味中药，中医还曾尝试用不同的复方草药产品治疗白癜风。用于白癜风的复方外用制剂治疗也已经在体内和体外获得了明确的药物功效。特别是祖国医学分支维吾尔医学中最常用的白癜风治疗方“Barres复方”。该制剂由五种草药(补骨脂、白花丹、荠菜、黑种草和驱虫斑鸠菊)的高温水提取物组成[2]。 在国外最新两项研究中表明其复方干预的白癜风皮损创面已经观察到良好的色素沉着和复色，推测其能刺激黑素细胞的黑素生成[3]。疮灵液也是一种纯中药外用药液，功效为活血化瘀、解毒，收敛生肌,由南京中医药大学第一附属医院即江苏省中医院在上世纪80年代研制，主要由大黄、红花、诃子、黄蜀葵花等组成，全方配伍，具有化瘀活血、收敛生肌、止痛消肿之效，符合中医治疗白癜风补益肝肾、活血化瘀为主的治疗大法。疮灵液安全性能较好，无毒无肝损，高效抗炎，对各种慢性溃疡及溃疡伴有炎症疗效显著[4]。临床观察到疮灵液治疗后的创面皮损色素有所加深，疗效类似于近期对于“Barresi复方”的研究推测也有增加人黑素细胞的黑素合成的可能性,因而研究了疮灵液对鼠永生化黑素细胞的作用，希望拓宽外用药的适应范围，为其治疗白癜风等皮肤科疾病、走向国际医学界提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 试剂配制

参照文献[5]，疮灵液原液(江苏省中医院研发自制，批号：1501001):设原液为1 g/mL，过滤除菌后分装于15 mL离心管中，并置于-20℃存放待用，使用前完全培养液稀释。完全培养液：F10培养液(Gibco)中加入59 ng/mL TPA(碧云天生物)及7%的马血清(Gibco)，混匀后于4℃存放。1% TritonX-100溶液：5 mL的PBS(Hyclone)溶液吸弃50 μL等体积加入50 μL TritonX-100，配制成5 mL的1%TritonX-100溶液。L-Dopa溶液：少量L-Dopa(Sigma)1M稀HCl溶解继续用 PBS溶液稀释，配平L-Dopa浓度至2 g/L。10%DMSO-NaOH溶液配制：2 gNaOH(Sigma)用ddH2O50 mL稀释到1 mol/L，弃去5 mL后等体积加入5 mLDMSO溶液，混合成含10%DMSO-NaOH混合液。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

冻存的鼠永生化黑素细LIOBIOBR-GFP(ATCC®CRL-2770TM)于恒温水浴箱中快速融化，然后室温低速离心机1 100 r/min离心6 min，加入5 mL完全培养液，吹打混匀后，种于10 cm培养皿，然后移入培养箱，第二天，倒置显微镜40倍镜下观察细胞贴附及生长状态，若细胞状态良好，此后约2 d换1次培养液[5]。细胞长到皿底60%面积后传代，按1∶3比例，传代后置于培养箱中继续培育，待3～4代时取对数成长期的细胞用于后续实验。

1.2.2 干预分组

从培养箱中取出传代完的黑素细胞，先用无菌PBS液清洗2遍，后吸出PBS加入1 mL胰蛋白酶，1 min后消化完全后加入完全培养液2 mL终止消化，吸入离心管, 置于常温低速离心机1 100 r/min离心5 min，1 mL移液器混匀，取10 μL加入10 μL台酚蓝混匀后于自动细胞计数板上机计数，稀释细胞浓度到5×104/mL，每孔100 μl种到96孔板，培养箱继续培育[5]。疮灵液按比例加完全培养液稀释，将其分别配制成50、100、200、400、800、1 600、3 200 μg/mL的相应溶液备用。24 h后吸出96孔板中的液体，加入各浓度的疮灵液，单独设一组无药物的孔为空白对照孔，每一组设立5个复孔，放于培养箱中继续培养，72 h后结束干预(黑素细胞形态见图1～8)。

图1 未给药6孔板内黑素细胞(×40)

图2 6孔板空白对照组黑素细胞(培养72 h后，×40)

图3 6孔板(50 μg/mL)药物剂量干预72 h黑素细胞(×40)

图4 6孔板(100 μg/mL)药物剂量干预72 h黑素细胞(×40)

图5 6孔板(400 μg/mL)药物剂量干预72 h黑素细胞(×40)

图6 6孔板(800 μg/mL)药物剂量干预72 h黑素细胞(×40)

图7 6孔板(1 600 μg/mL)药物剂量干预72 h黑素细胞(×40)

图8 6孔板(3 200 μg/mL)药物剂量干预后黑素细胞(×40)

1.2.3 黑素细胞增殖率的测定

采用MTT法测定其值。96孔板每孔分别加入50 μL1倍MTT溶液，放入37℃恒温箱，4 h后小心弃去液体后每孔加入100 μL DMSO后放入摇床充分振荡，10 min后待晶体溶解，置于酶标仪(预设490 nm)测量其吸光值[5]。重复以上实验3次。细胞增殖率结果等于加药组平均吸光值/空白组对照组吸光值(百分数)。

1.2.4 酪氨酸酶活性测定

96孔板弃掉液体，无菌PBS冲洗2遍后每孔加入l%TritonX-100试剂90 μL，然后放置于-80℃超低温冰箱中反应，30 min后，取出待其恢复到室温，每孔加入L-DOPA溶液10 μg，再放入37℃温箱中充分反应90 min，取出于酶标仪测吸光值(475 nm波长)[5]。重复以上实验3次。酪氨酸酶活性比率等于加药组平均吸光值/空白对照组平均吸光值(百分数)。

1.2.5 细胞黑素含量测定

6孔板吸弃液体，无菌PBS冲洗2遍，每孔加入胰蛋白酶200 μL充分消化，培养液终止消化后1 100 r/min离心5 min，再加入PBS溶液继续冲洗2遍沉淀。再加入配好的NaOH溶液，每管300 μL[5]。金属浴100℃加温30 min后冷却至常温，溶液混匀后移入96孔板中，放入酶标仪测吸光值(490 nm)，重复以上实验3次[5]。预实验将标准黑素按不同浓度加入96孔板测得黑素标准曲线，吸光值带进标准曲线计算得出黑素浓度值(mg/mL)，黑素含量结果等于加药组黑素浓度/空白对照组平均浓度(百分数)。

1.3 统计学方法

应用SPSS 24.0软件处理并分析实验数据，检验方差齐性后采用单因素方差分析比较差异性。结果若P<0.05为具有统计学上的差异，P<0.01是认为统计学上差异显著。

2 结果

2.1 疮灵液对于黑素细胞的增殖作用

由表1和图9可知，疮灵液低浓度(50 μg/mL)P值>0.05，高浓度(3 200 μg/mL)P值>0.05，说明最高和最低浓度的疮灵液对细胞增殖无显著作用;疮灵液浓度在100～1 600 μg/mL时，有增进黑素细胞生殖的作用(P值均<0.05)，而且在100～400 μg/mL时，其作用成剂量依赖性递增，在400 μg/mL时达到最大值。

表1 各浓度疮灵液对黑素细胞增殖的作用

图9 各浓度疮灵液对黑素细胞增殖的作用

2.2 疮灵液对黑素细胞中酪氨酸酶活性的作用

由表2及图10可见，当为50 μg/mL(低干预浓度)，与空白组相比，黑素细胞酪氨酸酶活性(P值>0.05)无显著统计学差异，对酪氨酸活性无明显作用；疮灵液浓度在≥100 μg/mL(高干预浓度)，均对酪氨酸酶活性有所增加(P值均<0.05)。特别在浓度在400 μg/mL以上，P值均<0.001，酪氨酸酶的活性显著增强。图10可见其对酪氨酸酶活性的影响大致也呈剂量依赖性递增。

表2 各浓度疮灵液对酪氨酸酶活性的作用

图10 各浓度疮灵液对酪氨酸酶活性的作用

2.3 疮灵液对黑素细胞黑素合成的作用

由表3及图11可见，50 μg/mL(低干预浓度)时，与空白组相比，黑素细胞黑素含量(P>0.05)无显著统计学差异，疮灵液在低浓度溶液对黑素细胞黑素生成无显著作用；在≥100 μg/mL(高干预浓度)时，(P<0.05)差异显著，黑素细胞的黑素合成均有所增加。

表3 各浓度疮灵液对细胞黑素含量的作用

图11 各浓度疮灵液对黑素含量的作用

3 讨论

白癜风影响世界0.5%的人口，是种后天慢性的损容类皮肤科疾病。白癜风以斑片状脱色为特征，其特点在于表皮和皮肤其他组织中的黑素细胞全部或部分丧失，功能性黑素细胞丧失的主要病理生理学原因被认为包括遗传易感性，自身免疫机制和氧化应激[6]。目前的现代医学治疗选择主要基于三种方法：(1)使用局部和全身免疫调节剂(主要是皮质类固醇和钙调神经磷酸酶抑制剂)调节自身免疫反应; (2)通过局部和全身抗氧化剂降低黑素细胞中的氧化应激;(3)使用光疗法(特别是UVB)和色素细胞移植激活黑素细胞再生[6]。白癜风一般呈慢性发病，病程较长，虽不影响患者生理健康，但其皮肤脱色的特征通常导致美容缺陷和患者相当大的心理困扰或心理问题，临床研究表明某些白癜风患者社会接受度降低的风险较高，生活质量也随之降低，可以推断这些患者更需要积极治疗该疾病,以提高其生活质量和社会接受度[7]。

随着现代医学对中药治疗白癜风机制的研究，各种中药外用制剂被开发出来。张春艳，许爱娥[8]根据中药的疗效、四气五味、归经所属和现代临床药理学研究成果，对以往文献中近30年来治疗白癜风的常用外用方药进行总结，统计得出结果: 补虚药、活血化瘀药、酪氨酸激活药、光敏感药在外用治疗白癜风中最常用。酪氨酸酶浓度及活性大小干预着黑素细胞中合成的黑素含量的多少，是黑素合成中关键的限速酶[9]。通过实验在临床活血化瘀方药中遴选出增加黑素生成的中药具有潜在的应用。疮灵液，是一种主要由大黄、诃子、红花、黄蜀葵花组成的外用中药制剂。许振毅[10]等研究得出大黄三种有效成分对酪氨酸酶的调节呈双向作用：芦荟大黄素(低剂量)提高细胞70%的酪氨酸酶活性，大黄次酸(高剂量)提高了细胞81%的酪氨酸酶活性，大黄素甲醚对酪氨酸酶的活性促进作用呈浓度依赖性。张理平[11]确定了酸性中药中28味成分提取物对黑素合成影响，其中诃子对酶活性影响呈在高浓度溶液时抑制，中、低浓度增加的双向作用。红花是传统中医常用的活血化瘀药，姜丽莎[12]等用主要成分为红花的院内自制擦剂干预豚鼠模型，结果显示复方红花酊高至中剂量治疗组有明显疗效，其机理可能是令一种重要的前炎性细胞因子TNF-α和免疫相关连的白介素因子IL-10的表达上升，进一步促进黑素合成和免疫抗氧化的调节来达到皮损色素沉着和复色的治疗目的。

氧化应激也是白癜风生成的重要病理机制，氧化应激可能触发通过黑素细胞自分泌释放HMGB1(一种晚期炎症介质)，抑制黑素细胞的表达Nrf2(一种保护细胞免受氧化损伤的关键因素)和下游抗氧化应激基因，直接或间接导致黑素细胞凋亡，参与白癜风的病理发病过程[13]。黄蜀葵花提取物具有良好的抗氧化性能和防止细胞内线粒体损伤功能，黎望[14]研究显示黄蜀葵花的主要成份黄酮类物质在0.04至0.60 mg/mL浓度时，对-OH 和H2O2导致的DNA氧化损伤都能起到保护作用，在0.12 mg/mL浓度时，对DNA损伤的保护作用最强。由此推测黄蜀葵花可能作用于白癜风氧化应激的病理机制以达到治疗的疗效。

综上，疮灵液的几种成分均有相关文献研究支持，理论上我们推测其可以从不同机制作用于黑素细胞达到治疗白癜风的效果。此前，疮灵液主要运用在促进创口愈合：许岩磊[15]等研究出疮灵液可以减少溃疡处炎症相关蛋白酶释放的同时增强组织基质生成的作用机理。张媞[16]等研究了疮灵液外用促进浆细胞性乳腺炎伤口愈合的疗效，得出疮灵液能够可以降低溃疡面IL-2、IL-4、IL-6等炎症因子从而减损伤处炎性症状,缓解疼痛,改善局部皮损病理和皮肤生理,减小肿块大小从而帮助组织再生。至今为止，在基础研究方面，疮灵液用于白癜风治疗存在空白。临床中我们观察到疮灵液治疗后的创面，不但愈合良好，甚至有些原皮损处色素有所加深。根据临床现象作者研究了疮灵液干预后，小鼠永生化黑素细胞(ATCC®CRL-2770TM)增殖率，酪氨酸酶活性以及黑素合成的改变，研究得出疮灵液对此三项指标均有增进作用。所以作者推测在黑素细胞黑素合成方面疮灵液对鼠永生化细胞具有一定的增进作用。本研究为疮灵液用于治疗白癜风等色素减退性疾病提供了理论依据，不足之处如：具体作用机制、有效成分及其剂量尚待进一步研究。