mTOR抑制剂对博来霉素诱导小鼠肺纤维化的作用研究

马爱平 李久荣 索文昊 周伟跃 叶美治 刘群

特发性肺纤维化（idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）是一种慢性肺疾病，主要表现为肺实质渐进性不可逆性纤维化进而降低肺功能为主要特征。IPF的患者会出现呼吸短促、咳嗽、不能参加日常体力活动等[1]。IPF的肺活检病理学表现可见进行性细胞外基质沉积，肺组织结构破坏，最终导致肺功能丧失[2]。IPF发病率呈现逐步上升的趋势，且死亡率居高不下，多为50岁以后发病，男性多于女性，其预后较差[3]。长期以来，治疗IPF的药物选择极少，以往IPF患者主要通过肺部康复运动、氧疗、肺移植及药物治疗等一系列综合治疗手段来延缓疾病发展，因此深入了解发病机制，寻找积极有效的治疗方法具有重要的意义。mTOR信号是调控细胞生长与分化的重要信号通路。mTOR信号通路调控了细胞增殖或凋亡，在临床疾病中参与了肿瘤、炎症、自身免疫性疾病的发生[4]。我们已发表的研究表明PI3K/Akt/HIF-1α的异常活化参与了肺纤维化的形成，mTOR信号通路的异常活化促进了肺纤维化形成[5]。现研究指出mTOR抑制剂能抑制小鼠肺纤维化进展和上皮向间质的转化，但也有研究提出了争议，故还需要寻找更多的证据来支持和探讨[6-8]。雷帕霉素是一种抗真菌和免疫抑制剂，能特异性抑制mTOR蛋白，通过阻断蛋白合成，诱导细胞周期停滞在G1期，达到免疫抑制作用。雷帕霉素主要用于器官移植抗排斥、自身免疫疾病和心脏支架涂层药物等[9-10]。研究结果显示雷帕霉素预处理不能有效改善博来霉素所致的小鼠肺纤维化。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物及分组 由厦门大学实验动物中心提供C57BL/6的雄性小鼠，体质量（23±1）g，全部饲养于SPF级实验动物房。并将实验用的C57BL/6雄性小鼠60只随机分为博来霉素肺纤维化对照组和雷帕霉素治疗组。

1.1.2 主要试剂及仪器 博莱霉素（15 mg/支，日本化药株式会社）、兔抗小鼠p-Akt单克隆抗体（美国CST公司）、兔抗小鼠Akt单克隆抗体（美国CST公司）、兔抗小鼠p-S6单克隆抗体（美国CST公司）、兔抗小鼠S6单克隆抗体（美国CST公司）、兔抗小鼠多克隆抗体β-actin（美国Santa Cruz公司）、羟脯氨酸试剂盒（美国BioVision）、Masson染液试剂盒（武汉博士德公司）、TRIzol Reagent（美国Gibco公司）。HE染色所需试剂、Westernblot器材、化学发光凝胶成像仪等由厦门大学医学院中心实验室提供。

1.2 方法

1.2.1 气管滴注博来霉素肺纤维化模型的建立及动物分组 备行气管内滴注博来霉素构建肺纤维化模型。在小鼠气管内滴注博来霉素前5天开始腹腔注射雷帕霉素（2 mg/kg），将60只小鼠分为腹腔注射赋形剂组30只和腹腔注射雷帕霉素（2 mg/kg）治疗组（30只），连续5日。进而对60只小鼠行气管内滴注博来霉素。即用2%戊巴比妥钠换算成70 µg腹腔注射小鼠使其麻醉，将小鼠用特殊固定夹固定于实验操作台，剪去颈部鼠毛，再用碘伏消毒手术部位皮肤，小动物手术剪剪开颈前正中皮肤，钝性分离颈前肌肉最终暴露气管。再以1 mL注射器气管内滴注博来霉素（2.5 mg/kg），赋形剂组给予等剂量0.9%氯化钠溶液，快速提起小鼠左右旋转，使药物在肺内分布均匀，最后缝合颈部皮肤。此后每日观察小鼠生存情况和呼吸道反应，记录每日体重及每日死亡数量，21天后处理小鼠，收集肺脏等相关标本进行下一步实验。

1.2.2 小鼠肺病理标本HE染色及纤维化Ashcroft评分 将固定好的组织用PBS清洗两遍，每次30 min，组织脱水，二甲苯透明，浸蜡，切片，摊片，中性树胶封片（注意材料上的二甲苯不能干，尽量避免出现气泡。光镜下以各肺叶肺组织水肿、出血、炎性细胞浸润和小气道损伤等项病理改变。肺组织纤维化Ashcroft评分按文献所示。每张片子取5个以上视野，求出每只小鼠肺的各项病理改变程度的平均程度，作为肺纤维化分数，然后成组统计分析Ashcroft评分。

1.2.3 Masson染色评估肺部纤维化程度 石蜡切片脱蜡至水，依次自来水和蒸馏水洗，再用Regaud苏木精染液或Weigert苏木精液染核5 min，用Masson 丽春红酸性复红液5 min，以2%冰醋酸水溶液浸洗片刻，1%磷钼酸水溶液分化3 min，直接用苯胺蓝或光绿液染5 min，最后以0.2%冰醋酸水溶液浸洗片刻，95%酒精、无水酒精、二甲苯透明、中性树胶封固。

1.2.4 Western blotting测定mTOR信号通路蛋白表达 将新鲜肺组织称重，取100 mg组织加入1 mL Ripa裂解液，在超声匀浆机上打碎肺组织，12 000 rpm，4℃离心，蛋白变性后将上清分装存于-20℃保存。每份实验样品选取30 µg上样，配制SDS-PAGE凝胶，把蛋白样品直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内并电泳，使用Bio-Rad的标准湿式转膜装置，设定转膜电流为300 mA，转膜时间为60分钟，将蛋白转到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，随后使用封闭液5%牛血清白蛋白（BSA）的TBST缓冲液在室温封闭4小时，用TBST 1：1000稀释兔抗鼠p-Akt、Akt、p-S6，β-actin一抗，孵育4℃过夜。再用TBST 1：5 000稀释的二抗4℃孵育2 h。洗膜再于暗室中用ECL法检测蛋白，以β-actin蛋白作为上样量的参照。

1.2.5 羟脯氨酸含量的测定 取冻存的左肺肺组织称重，取湿重10 mg，将样品反复绞碎，充分混合，然后根据碱水解法测定，按标准曲线和稀释倍数计算羟脯氨酸含量，评估纤维化病变程度。

1.3 统计学方法

研究数据应用SPSS l7.0软件进行统计分析。计量资料以（Mean±SEM）表示。两组间比较采用t检验或非参数检验，P＜0.05差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 mTOR抑制剂雷帕霉素对纤维化肺组织内mTOR信号通路的作用情况

收集博来霉素造模后21天的两组肺组织标本，各10例。用Western blotting检测两组小鼠肺组织中磷酸化修饰的Akt（p-Akt）及Akt，磷酸化修饰的S6（p-S6）蛋白的表达量变化。对照组（腹腔注射赋形剂组）内小鼠肺组织的p-S6蛋白表达量增加，而p-Akt蛋白表达量减少，提示mTOR通路活化。与对照组相比，治疗组经雷帕霉素预处理后，抑制了小鼠肺组织中S6蛋白的磷酸化水平，并增加了Akt Ser473位点的磷酸化水平，详见图1。

2.2 小鼠肺组织病理形态学变化

图1 雷帕霉素抑制肺纤维化小鼠肺内的mTOR信号通路

图2 雷帕霉素预处理后肺纤维化小鼠肺组织病理学分析（×200）注：图A中，a：博来霉素对照组小鼠肺组织HE染色；b：雷帕霉素治疗组的小鼠肺组织HE染色；c：博来霉素对照组的小鼠肺组织Masson染色；d：实验组小鼠肺组织Masson染色（×20）。

对小鼠气管内滴注博来霉素行肺纤维化模型，在纤维化病变21天时取两组肺组织做病理切片各15例。结果显示两组小鼠肺组织肺泡结构均被明显破坏，周围纤维化条索分布。肺泡间隔增厚并伴大量炎性细胞浸润，见箭头显示（图2A a～b）。在Masson染色中，对照组与治疗组均可见阳性蓝染分布，实验组肺组织可见肺间质散在纤维条索分布，呈蓝染的条状胶原纤维以气道周围和胸膜下分布为主。两组肺组织均可见肺泡间隔增宽，肺泡腔缩小，肺纤维化形成明显的表现（图2A c～d）。图2B为Masson染色的定量比，对照组与治疗组差异无统计学意义[（1.00±0.00） vs.（1.12±0.07）]，P＞0.05。

2.3 对小鼠肺纤维化程度评估

在纤维化模型的第21天，收集所有两组小鼠肺组织用Ashcroft评分评估60例标本纤维化严重程度，结果显示两组小鼠的肺纤维化评分差异无统计学意义[（4.45±0.12） vs. （4.62±0.74）]，P＞0.05，见图3A。与对照组相比，实验组小鼠肺组织中羟脯氨酸含量无增高[（0.54±0.09） vs. （0.56±0.03）]，P＞0.05，见图3B。

3 讨论

mTOR信号由磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）、蛋白激酶B（Akt）、结节性硬化复合物（TSC1/2）等上游分子及真核细胞翻译起始因子4E结合蛋白1（4EBP-1）、核糖体蛋白S6激酶（SK6）下游分子所组成。下游S6蛋白的磷酸化是mTORC1活化的标记，活化的mTORC1继而通过下游的S6K1和4EBP1磷酸化促进细胞内关键蛋白的转录、翻译和自噬表达，促进了蛋白的合成和细胞生长[11-12]。

我们已发表的研究显示肺纤维化病变的小鼠肺组织存在mTOR的过度活化，异常活化的mTOR参与了肺纤维化发病过程。其可能机制与肺组织中释放纤维化细胞因子表达增加、肌纤维化母细胞增生，进而促进了胶原蛋白的合成有关[13]。还有数据显示用CCSP/TGF-α转基因小鼠构建肺纤维模型，mTORC1的下游因子S6K活化后加重了肺纤维化病变，而使用S6K抑制剂LY2584702干预则抑制了肺纤维母细胞的增殖和纤维化发病[14]。在体外IPF患者肺纤维母细胞中，mTORC1/2抑制剂P529抑制了TGF-β诱导的肌纤维母细胞的分化和基质金属蛋白酶的沉积[15]。抑制mTOR的异常活化是否是治疗肺纤维化的新方向需要进一步明确。

在本研究结果中，我们在肺纤维化造模前第5天腹腔注射mTOR信号抑制剂雷帕霉素预处理，小鼠一般状态尚可。Western blotting结果显示治疗组中p-S6表达下降，提示雷帕霉素有效抑制了肺纤维化组织中mTOR活性。给予雷帕霉素同赋形剂组相比，肺病理损伤结果大致相似，两组肺组织均有炎症细胞浸润、肺泡结构破坏、胶原纤维在肺泡间隔沉积呈现肺间质纤维化表现。进一步分析提示赋形剂组与雷帕霉素组在胶原纤维表达方面无差异。实验结果中Ashcroft评分和羟脯氨酸含量检测在两组小鼠中无统计学变化，说明雷帕霉素预处理不能有效改善博来霉素所致的小鼠肺纤维化损伤。

图3 肺纤维化程度的评估

但本研究中也存在局限的地方，气管内滴注博来霉素造模前第5天使用雷帕霉素预处理可导致小鼠体重增长受到抑制。雷帕霉素连续用药或多次间断给药是否能更有效改善小鼠肺纤维化病变。在我们的预实验结果中，进一步增大雷帕霉素剂量可引起小鼠过度消瘦不耐受纤维化病变从而增加死亡率。故更合理的调整雷帕霉素用量与用法改善肺纤维化病变仍需进一步摸索。在今后的研究工作中，我们还需进一步了解雷帕霉素后期治疗是否能改善博来霉素所致的小鼠肺纤维化。