盐酸芬戈莫德对结肠癌小鼠肿瘤免疫相关因子的影响

阮志燕 陈庆凤 赖满香

广东食品药品职业学院药学院，广东广州 510520

盐酸芬戈莫德（FTY720）作为一种新型免疫抑制剂治疗器官移植[1]和多发性硬化[2]等免疫性疾病，主要激动S1P受体，从而具有特异性免疫抑制功能[3]。近年来，不断有文献报道FTY720可以抑制动物模型的肿瘤的生长和转移[4-5]和增强抗癌药的抗肿瘤活性[6]，抗瘤机制不尽相同，涉及鞘氨醇激酶、原癌基因等多个方面[7]。肿瘤细胞逃避患瘤机体的免疫杀伤作用一直是抗肿瘤免疫研究的重点，从提高机体抗肿瘤免疫的角度寻找有效的抗肿瘤药物是目前的常规方法。选择IFN-γ对肿瘤细胞的杀伤作用[8]和Tregs的免疫抑制功能[9]作为研究肿瘤免疫的主要指标。通过检测免疫效应细胞分泌IFN-γ的量和Tregs的数量及免疫抑制功能的变化来观察肿瘤机体的免疫状态，结合药物的抗瘤效果，对肿瘤模型的免疫状态有重要的提示意义[10]。本研究着重于观察盐酸芬戈莫德对荷瘤小鼠肿瘤免疫相关因子效应T细胞、IFN-γ和Tregs细胞的影响，以期了解盐酸芬戈莫德的抑制肿瘤作用。

1 资料与方法

1.1 细胞和药物

小鼠结肠癌细胞株CT26.WT（CT26）；盐酸芬戈莫德（FTY720，纯度≥98%）。

1.2 实验动物

SPF级别雌性BALB/c小鼠，6～7周龄，体重（16±2）g，购自于广东省实验动物中心。

1.3 主要试剂和仪器

PMA/Ionomycin/BFA/Monensin mixture（250×）（杭州联科生物技术有限公司），I型DNA酶和透明质酸酶（上海易立生物科技有限公司），单克隆抗体FITC anti-mouse CD3e、PE-Cy7 anti-mouse CD8a、APC anti-mouse CD25、PE-Cy7 anti-mouse CD3、FITC anti-mouse CD4、PE anti-mouse IFN-γ、PE anti-mouse IL-10（美国eBioscience公司），流式细胞仪BD FACSCanto Ⅱ（美国BD公司）。

1.4 结肠癌小鼠模型的建立及抑瘤效果

使用随机数字表对小鼠进行随机分组，FTY720高、中、低剂量治疗组（n=10，共30只）和荷瘤模型组（n=10）接种CT26细胞，阴性对照组（n=10）接种生理盐水。按CT26细胞数2×106个/只接种，接种后第4天，连续14d灌胃给药。

1.5 肿瘤抑制率、胸腺指数、脾脏指数的测定

第14天给药后24h处死小鼠，摘眼球取外周血、另外取胸腺、脾脏、接种侧腋下淋巴结和肿瘤组织。胸腺、脾脏和肿瘤精密称重后计算肿瘤抑制率、胸腺指数和脾脏指数。抑瘤效果使用抑瘤率表示，抑瘤率=（1-盐酸芬戈莫德治疗组平均瘤重/模型组平均瘤重）×100%。脾脏指数=脾脏质量（mg）/小鼠体质量（g），胸腺指数=胸腺质量（mg）/小鼠体质量（g）。

1.6 小鼠不同组织效应T细胞CD8+CD3+T细胞的比例

在无菌条件下剥离肿块，滤纸吸净表面液体，剪碎，玻璃针芯轻柔碾压，筛网过滤获取组织细胞，使用胶原酶、DNA酶和透明质酸酶消化6h，再用淋巴细胞分离液，获得肿瘤组织来源的淋巴细胞。单克隆表面抗体CD3和CD8染色后上流式细胞仪检测。

按照下列公式计算：Teff细胞数百分比=（CD3+CD8+细胞数/CD3+细胞数）×100%

1.7 小鼠不同组织T细胞的IFN-γ和CD4+CD25+Tregs IL-10的分泌

按流式细胞术处理外周血和淋巴结样本取得相应细胞，将收集的外周血、淋巴结和肿瘤3种来源的淋巴细胞按5×104个细胞/孔铺板，设置复孔3个，按说明书加入PMA/Ionomycin/BFA/Monensin mixture刺激，37℃，5%CO2，孵育过夜。CD3、CD4和CD25标记Treg细胞，分别进行细胞表面抗原染色和细胞内细胞因子IFN-γ和IL-10染色。

1.8 统计学方法

采用SPSS17.0 for Windows软件对实验数据进行统计学分析，计量资料以（±s）表示，多个样本均数组间比较采用方差分析，多个样本均数间两两比较使用q检验分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 FTY720对荷瘤小鼠肿瘤生长的抑制作用

荷瘤模型组剥离的肿块平均重量为（0.99±0.27）g，FTY720高、中、低剂量治疗组的抑瘤率呈剂量正相关性，最高达61%，最低为33%，提示FTY720有抑制小鼠实体肿瘤的生长的作用，FTY720高、中、低剂量治疗组、荷瘤模型组组间比较，差异有统计学意义（F=30.928，P＜0.05），FTY720不同剂量组和荷瘤模型组比较，肿瘤重量明显减轻，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 FTY720的抑瘤率（n=10）

2.2 FTY720对荷瘤小鼠脏器指数的影响

和阴性对照组的数据相比，小鼠接种CT26肿瘤细胞后胸腺指数和脾脏指数明显下降，差异有统计学意义（P＜0.05）；和荷瘤模型组的脏器指数相比，不同剂量给药组明显提高了小鼠的胸腺指数（F=15.965）和脾脏指数（F=14.413），尤其是高剂量组的小鼠脏器指数上升更为显著，比较差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 FTY720对荷瘤小鼠脏器指数的影响（n=10）

2.3 FTY720对荷瘤小鼠肿留免疫相关因子的影响

2.3.1 小鼠不同组织中的CD8+CD3+T细胞的比例 荷瘤模型组外周血和淋巴结中Teff细胞的比例显著高于阴性对照组；FTY720不同剂量治疗组与荷瘤模型组的数据比较发现，治疗组的外周血（F=59.636）和淋巴结（F=52.952）Teff细胞的比例均是下降的，并且下降趋势与剂量呈相关性；观察肿瘤局部Teff细胞数据发现，FTY720高、中剂量治疗组与荷瘤模型组的数据差异有统计学意义（F=52.985，P ＜ 0.05）。见表 3。

表3 不同组织内CD8+CD3+Teff细胞百分比（n=8）

2.3.2 小鼠不同组织CD3+T细胞的IFN-γ的分泌 荷瘤模型组的外周血中和淋巴结中的CD3+T细胞分泌IFN-γ的比例均比阴性对照组的数据低。不同剂量治疗组的数据提示，FTY720显著升高三种不同组织来源的CD3+T细胞分泌IFN-γ的比例，组间差异有统计学意义（P＜0.05），并且升高的数值随着用药剂量而变化。见图1。

图1 分泌IFN-γ的CD3+T细胞百分比

2.3.3 小鼠不同组织CD4+CD25+Tregs的IL-10分泌 荷瘤模型组的小鼠外周血和淋巴结的CD4+CD25+Tregs分泌IL-10的比例相比阴性对照组显著升高，组间差异有统计学意义（P＜0.05）；盐酸芬戈莫德显著降低了CD4+CD25+Tregs分泌IL-10的细胞比例，组间差异有统计学意义（P＜0.05），用药剂量越大，降低比例越明显，提示盐酸芬戈莫德可以通过减少IL-10的分泌来对抗肿瘤小鼠CD4+CD25+Tregs的免疫抑制作用。见图2。

图2 分泌IL-10的CD4+CD25+Tregs细胞百分比

3 讨论

我们分别从效应T细胞的数量和肿瘤免疫相关的关键细胞因子两个方面，研究盐酸芬戈莫德对结肠癌小鼠肿瘤免疫相关因子的影响。从实验结果来看，盐酸芬戈莫德升高了肿瘤局部CD3+CD8+T细胞的比例，这些小鼠外周血和淋巴结、甚至肿瘤局部的CD3+T细胞分泌IFN-γ的比例明显增强；Sasidharan报道Tregs在局部造成的免疫抑制微环境是帮助肿瘤细胞逃避免疫杀伤的关键[11]，肿瘤局部Tregs和CD8+T细胞的此消彼长影响肿瘤的生长[12]；CD8+T的细胞数量和IFN-γ的分泌量是衡量机体抗肿瘤免疫的常见指标，治疗组的数据提示盐酸芬戈莫德有提高CD8+T的细胞数量和IFN-γ的分泌量的作用。

另外一方面，Tregs在肿瘤机体的免疫抑制作用不只是存在于肿瘤局部，其分泌的细胞因子IL-10也是抑制抗肿瘤免疫的主要指标[13]，在小鼠外周血和肿瘤相关淋巴结中的CD4+CD25+Tregs分泌IL-10的能力增强，意味着荷瘤小鼠肿瘤局部的免疫抑制状态较强，实验数据显示盐酸芬戈莫德显著降低了外周血和肿瘤引流淋巴结CD4+CD25+Tregs分泌IL-10的细胞比例，可能在肿瘤免疫中起到抑制Tregs功能的作用。

胸腺指数和脾脏指数是反映小鼠机体整体免疫状态的常用指标[14]，检测脏器指数从侧面反映盐酸芬戈莫德对结肠癌小鼠肿瘤免疫状态的影响。荷瘤模型组的胸腺指数和脾脏指数数据显示机体免疫状态受到明显抑制，盐酸芬戈莫德明显改善因肿瘤导致的脏器指数下降。

我们推测肿瘤的生长受到抑制与以下几个方面相关：胸腺指数和脾脏指数回升、CD3+CD8+T细胞的比例提高、CD3+T细胞分泌IFN-γ的水平增强以及CD4+CD25+Tregs分泌IL-10的细胞比例下降。这些数据提示盐酸芬戈莫德可能加强了荷瘤机体的抗肿瘤免疫反应，增强了免疫效应细胞的数量和功能，抑制了Tregs免疫抑制功能和肿瘤局部Tregs的数量，从而抑制肿瘤在小鼠体内的生长。

目前盐酸芬戈莫德的作用靶点尚不清楚，但是其对Tregs的影响是比较明显的，其机制可能是盐酸芬戈莫德影响了Tregs向肿瘤局部的迁徙[15]。我们的研究也表明，盐酸芬戈莫德对结肠癌模型小鼠体内肿瘤免疫因子的影响，提高外周血和淋巴结中T细胞分泌IFN-γ的能力，同时抑制CD4+CD25+Tregs分泌IL-10的作用来发挥作用，这一结果与Zhao等[16]报道的炎症性肠病的结果类似。