红景天苷对诱导的成骨细胞在低氧环境中的保护作用

沈新升，陈鸥，赖宪良，苏嘉

（温州市中西医结合医院 骨科，浙江 温州 325000）

骨缺损是临床治疗中常见的难题，组织工程学细胞经分化后提供分化的成骨细胞[1-3]，这些细胞具有成骨细胞的生理功能，是目前研究的热点。但这些诱导的细胞随着分化增殖的代数增多，表现出衰老的迹象，不能很好地维持自身的功能，给临床转化带来了限制。诱导性多潜能干细胞（induced pluripotent stem cells，IPS细胞）是能无限制定向分化为各种间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）的种子细胞[4]。目前已有将IPS细胞分化为成骨细胞的报道[5-7]。然而IPS细胞在低氧环境中的生理状态及能否发挥生理作用目前尚不清楚，有报道认为红景天苷对细胞在低氧环境中有保护作用[8]。本研究对IPS诱导的成骨细胞分成正常组、低氧组、红景天苷预处理组，探讨红景天苷对IPS诱导的成骨细胞在低氧环境的生理状态的保护作用以及可能的机制。

1 材料和方法

1.1 材料 小鼠胚胎成纤维细胞购自上海典藏细胞库，293T细胞购自上海斯丹赛生物技术有限公司，BALB/c型4周龄小鼠购自温州医科大学动物实验中心，实验动物许可证号：SYXY（浙）2010-0150，实验在温州市中西医结合医院细胞实验中心进行。含Oct4、SOX2、C-MYC和KLF4的慢病毒质粒由广州四和公司包装， II型胶原蛋白酶和胰酶（美国Sigma公司），胎牛血清、DMEM/F12培养基、100×青链霉素（美国Gibco公司），抗坏血酸、甘油磷酸、地塞米松（美国Sigma公司），β-actin抗体（美国Proteintech集团），RIPA细胞裂解液、BCA蛋白含量测定试剂、SDS-PAGE凝胶配制试剂盒、DAB发光液、TBST液（上海碧云天公司），FITC/PI试剂盒（美国Sigma公司）。红景天苷（纯度＞99%，中国药品生物制品鉴定所）。低氧诱导因子-1（hypoxia induced factor-1，HIF-1α）、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）抗体（美国Sigma公司），聚凝胺溶液（上海碧云天公司），Defined FBS（美国Gibco公司）。内源性基因Nanog、Oct-4、Rexl、Sox-2的QT-PCR检测试剂盒由广州四和公司提供。

1.2 成纤维细胞分离培养方法 将BALB/c型小鼠夹头处死，剥取皮肤，剔去皮下组织、血管和血迹，含1%青链霉素的PBS 30 mL冲洗3次，每次30 s。采用组织块法，将皮肤剪成0.1 cm×0.1 cm×0.1 cm大小的组织块，接种于75 mL培养瓶中，2 mg/mL II型胶原蛋白酶消化，于5% CO2、21% O2、37 ℃条件下过夜，PBS液清洗后，0.25%胰酶消化，用含胎牛血清的DMEM/F12清洗，1500×g离心10 min，取上清液加入含10%胎牛血清的DMEM/F12，按1×105/mL接种于培养瓶中。每2～3 d更换DMEM/F12培养液1次。等细胞爬满培养瓶底部约占80%时，胰酶消化传代。收集第三代培养细胞。

1.3 小鼠胚胎成纤维细胞（mouse embryonic fibroblast，MEF）滋养层制备方法 取MEF，0.25%胰酶消化，加入含10%胎牛血清的DMEM/F12，按1×105/mL接种于培养瓶中。爬满80%瓶底后，加入4 mL 10 μg/mL的丝裂霉素C处理MEF细胞2 h，弃掉丝裂霉素C，PBS清洗2次，用0.1%基质胶预处理，转移至培养瓶中。

1.4 IPS细胞的诱导和培养方法 采用磷酸钙转染法将含Oct4、SOX2、C-MYC和KLF44种cDNA的慢病毒质粒转染到293T细胞中，提取病毒上清液。取等体积病毒上清液和4 mg/L聚凝胺溶液混合，替换成纤维细胞培养基，5% CO2、21% O2、37 ℃培养箱中孵育6 h。将诱导的细胞以1×105个/mL的密度接种于失活的MEF上48 h后，培养基改换成Defined FBS，置于37 ℃，5% CO2培养箱培养，每72 h传代一次，取第三代细胞，按照说明书进行小鼠成纤维细胞行内源性基因Nanog、Oct-4、Rexl、Sox-2的QT-PCR检测。

1.5 IPS细胞诱导为成骨细胞方法 取第三代培养的细胞，经过离心机分离，然后用0．25%胰蛋白酶处理成单细胞转移到含有明胶涂层的培养皿上进行悬浮培养，培养液为成骨分化培养液，其包含50 μg/mL抗坏血酸，lO nmol/L地塞米松，5 mmol/L 3-甘油磷酸。培养液每3 d换1次，细胞在第21天时按照实验试剂说明书进行茜素红染色。

1.6 分组方法 诱导后的成骨细胞分成3组（对照组、低氧组、红景天苷预处理组）。对照组于5% CO2、21% O2、37 ℃条件下培养12 h。低氧组于5% CO2、0.5% O2、37 ℃条件下培养12 h。红景天苷预处理组于5% CO2、5% O2、37 ℃条件下在含1 mg/L的红景天苷培养液中培养24 h，转移至5% CO2、0.5%O2、37 ℃条件下继续培养12 h（其余条件不变）。

1.7 Annexin V-FITC/PI检测细胞凋亡率 用胰酶+EDTA混合液消化细胞，制成单细胞悬液，调整细胞密度为1×106个/mL，按试剂盒操作说明书操作，计算FITC单染（Q3）与-FITC/PI双染（Q2）的阳性细胞百分数之和作为该样品细胞凋亡百分数。

1.8 Western blot检测VEGF和HIF-1α表达量 分组提取细胞总蛋白，按照VEGF和HIF-1α的Western blot检测的实验试剂盒操作说明书步骤操作，运用Bio-Rad公司的Quantity One软件对Western blot结果进行图像分析。

1.9 统计学处理方法 采用SPSS13.0软件对数据进行统计学分析。计量资料用±s表示，多组间比较用单因素方差分析，组间两两比较用LSD检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 IPS细胞内源性基因Nanog、Oct-4、Rexl、Sox-2表达结果 重编程的细胞的干细胞标志物内源性基因Nanog、Oct-4、Rexl、Sox-2在IPS细胞中的表达量明显高于在小鼠成纤维细胞中的表达量，差异有统计学意义（P＜0.05），见图1。

图1 IPS细胞内源性基因Nanog、Oct-4、Rexl、Sox-2在IPS细胞和成纤维细胞中的表达量

2.2 IPS细胞成骨定向分化后的细胞茜素红染色结果 IPS细胞成骨定向分化后的细胞茜素红染色表达阳性，见图2。

图2 IPS细胞成骨定向分化后细胞染色结果（茜素红染色，×200）

2.3 3组诱导后的成骨细胞Annexin V-FITC/PI检测细胞凋亡率比较 正常组细胞组凋亡率为0.88%±0.18%，红景天苷预处理组为35.65%±3.92%，低氧组凋亡率为95.20%±1.03%。正常组和红景天苷预处理组凋亡率低于低氧组，差异有统计学意义（P＜0.05）；正常组凋亡率低于红景天苷预处理组，差异有统计学意义（P＜0.05），见图3。

图33组诱导后的成骨细胞凋亡率Annexin V-FITC/PI检测分析图

2.4 3组诱导后的成骨细胞VEGF和HIF-1α蛋白水平比较 红景天苷预处理组VEGF蛋白表达量高于低氧组，差异有统计学意义（P＜0.05）。红景天苷预处理组HIF-1α蛋白表达量高于低氧组，差异有统计学意义（P＜0.05）。正常组的VEGF蛋白表达量高于低氧组，差异有统计学意义（P＜0.05）。正常组的HIF-1α蛋白表达量高于低氧组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图4。

3 讨论

研究发现，IPS细胞经培养诱导后，能诱导出符合成骨细胞生物学活性和表型的细胞。OKAMOTO等[9]用2-硫基乙醇和抗白血病因子将IPS细胞定向分化成成骨细胞。钱浩等[10]用抗坏血酸、地塞米松和3-甘油磷酸等将IPS细胞定向分化成成骨细胞。茜素红染色是成骨细胞的特异性染色检测。本研究中重编程的细胞的Nanog、Oct-4、Rexl、Sox-2的表达明显高于成纤维细胞的表达，说明重编程的细胞具有IPS细胞的特征。而重编程的细胞经诱导后，茜素红染色阳性，表明诱导后的细胞成骨分化程度高。因此可以认为重编程的IPS细胞能定向诱导分化为成骨细胞。

图43组诱导后的成骨细胞HIF-1α和VEGF的蛋白表达

种子细胞在低氧环境中是否可以存活，目前仍存在着争论。GENG[11]将MSCs注射到发生心肌梗死小鼠的心室，4 d后99%的MSCs死亡，表明缺血缺氧环境中细胞存活困难。但FOLLMAR等[12]发现在0.1%O2（极度低氧）下兔来源的干细胞死亡增多，但在有限的氧浓度下细胞依旧可以存活。给予适当的干预，提高细胞的抗凋亡能力，有助于提高低氧环境中细胞的生存能力。

HIF-1是缺氧条件下传递缺氧信号、介导缺氧效应的关键转录因子，通过与缺氧相关反应元件结合，刺激下游相关基因表达，促进血管生成。HIF-1的结构由HIF-1α和HIF-1β组成，其中HIF-1α发挥主要的生物学活性。红景天苷是从中药红景天中提取的化学成分，在减轻缺氧症状和抗氧化方面具有重要作用[13]。李庆勇等[14]发现在低氧情况下，组织的HIF-1α表达会增加，然而在本研究中，低氧组的诱导后成骨细胞表达HIF-1α低于正常组。这可能是由实验设计中低氧的浓度不同，同时HIF-1α极不稳定，容易丢失等情况引起。在本研究中，红景天苷预处理组的HIF-1α表达高于低氧组，差异有统计学意义；其与正常组比较差异无统计学意义，表明红景天苷能提高细胞的HIF-1α的表达，并对HIF-1α起到稳定的作用，与STEGEN等[15]的研究结果一致。

VEGF是HIF-1α的下游基因，HIF-1α的增加能促进VEGF的表达。在本研究中发现诱导的成骨细胞在红景天苷预处理组与低氧组比较时，VEGF表达升高，表明红景天苷通过提高诱导后成骨细胞HIF-1α的表达，间接促进VEGF的表达。有研究[16-17]认为VEGF可以抑制细胞的凋亡，改善细胞的状态。本研究Annexin V-FITC/PI凋亡率检测实验结果显示，红景天苷预处理组的成骨细胞凋亡率明显低于低氧组。KLUCK等[18]发现在细胞凋亡早期，给予刺激因素可以挽救细胞，使其恢复正常的生理。因此，本研究认为用红景天苷预处理的方法可以提高低氧情况下诱导后成骨细胞的生理状态，对诱导的成骨细胞有保护作用，其机制可能为红景天苷通过提高诱导后成骨细胞HIF-1α的表达，间接促进VEGF的表达，发挥抑制诱导的成骨细胞凋亡的作用。