α-突触核蛋白原纤维诱导的帕金森病小鼠模型的行为表型及病理特征

田静，侯志东，任湘鹏

（温州医科大学附属眼视光医院 实验室中心，浙江 温州 325027）

帕金森病（Parkinson’s disease，PD）是第二大常见的进行性神经退行性疾病，其主要临床表现为静止性震颤、肌强直、运动迟缓和姿势不稳等运动症状；典型的病理特征为中脑黑质致密区（substantia nigra pars compacta，SNpc）多巴胺（dopamine，DA）能神经元进行性变性缺失，残存的DA能神经元胞质内出现路易小体（Lewy bodies，LBs），即α-突触核蛋白（α-synuclein，αS）包涵体。目前PD的病因和发病机制尚不完全清楚，现有的临床药物只能缓解PD症状，不能有效地阻断或延缓PD病理进程，其中一个重要的原因是缺乏阐明PD发病机制的理想动物模型。近年来学术界普遍认为αS异常聚集和病理传播是PD发病的核心机制[1]，具体表现为：αS编码基因的遗传多态性（如A53T突变）是导致家族性PD的重要原因[2]，而错误折叠的αS聚集体是PD病理标志物LBs的主要成分[3]，因此基于αS的PD动物模型成为研究热点[4]。采用脑内注射重组αS原纤维，模拟胞外αS在神经元之间传播扩散的朊病毒样特性而建立的αS原纤维PD模型为研究PD的病理机制提供了崭新的动物模型[5]。将错构的αS原纤维直接注射至正常小鼠纹状体脑区，发现αS可由纹状体扩散到中脑SNpc区，导致DA能神经元变性丢失、运动和认知损伤等PD病理特征[6]。然而，αS原纤维在中脑SNpc区直接导致的DA能神经元病理变化及行为学表型尚不清楚。本研究利用小鼠脑内SNpc定位注射A53T突变型αS（A53T αS）原纤维的方法，建立PD小鼠模型，检测模型小鼠的运动和认知行为学表型，并采用免疫组织化学染色法观察模型小鼠脑内典型的病理特征，为进一步探索αS在PD中的病理机制提供实验基础。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂：重组A53T αS蛋白[纯度＞95%，辉源生物科技（上海）有限公司]，抗磷酸化α-突触核蛋白（phosphorylated α-synuclein，pSyn）、抗酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase，TH）及小胶质细胞特异性蛋白（ionized calcium binding adapter molecule 1，IBA-1）单克隆抗体购自美国Abcam公司，ABC免疫组织化学检测及DAB试剂盒购自德国Vector公司，其余生化试剂为国产分析纯。

1.1.2 实验动物：健康10～12周龄雄性C57BL/6小鼠20只，体质量22～26 g，购自上海斯莱克实验动物公司，实验动物许可证号：SYXK（沪）2017-0008，在温州医科大学眼视光学院动物房内饲养。室温控制在（24±2）℃，湿度控制在（60±2）%，日光灯照明250～300 lux，拥有自动定时装置的12h/12 h光照/黑暗环境。给予每笼小鼠充足的水粮，适当活动空间，小鼠能够自由进水、摄食。所有动物的使用均遵照国家科学技术委员会于1988年颁布的《实验动物管理条例》，并通过温州医科大学动物使用伦理委员会审核。

1.1.3 主要设备：脑立体定位仪（美国KOPF公司），手术显微镜及正置荧光显微镜（德国Zeiss公司），手术器械（深圳瑞沃德公司），微量注射器（美国Hamilton公司），超低温冰箱及冷冻离心机（美国Thermo公司），冰冻切片机（德国Leica公司），旷场实验箱及Y迷宫（上海优耳仪器科技有限公司），行为学视频分析软件（荷兰Noldus公司），精密电子天平（Satorius BS124S，北京赛多利斯仪器系统有限公司），旋涡混合器（XW-80，上海医科大学仪器厂），超纯水器（UPWS-1-20T，杭州永洁达净化科技有限公司），pH计（Delta 320，上海峰至仪器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 A53T αS原纤维制备及处理[7]：重组A53T αS用无菌PBS稀释到5 mg/mL，37 ℃下以1000 r/min的转速持续震荡孵育，使A53T αS蛋白组装成原纤维。将A53T αS稀释至1 mg/mL，分装100 μL/管，-80 ℃保存备用。低温下用超声破碎仪短暂超声处理后用于脑立体定位注射。

1.2.2 动物分组：将20只雄性健康成年C57BL/6小鼠随机分为2组，每组10只，模型组小鼠注射A53T αS原纤维，对照组注射无菌PBS。小鼠分笼饲养，每笼5只。

1.2.3 A53T αS原纤维PD小鼠模型的建立[7]：小鼠进行SNpc脑区的单次双侧立体定位注射造模。参照《小鼠脑立体定位图谱》，SNpc脑区注射坐标定位为：前囟后（AP）-3.16 mm，旁开（ML）±1.25 mm，深度（DV）-4.00 mm。小鼠麻醉、固定，剪开头皮暴露术野，进行SNpc定位及钻孔，最后使用Hamilton微量注射器于SNpc坐标缓慢双侧注射5 μg A53T αS原纤维及无菌PBS。注射结束后，留针5 min后缓慢拔出针头，并于颅骨表面撒少许青霉素粉末防止感染。术后将小鼠置于恒温恢复器，待小鼠苏醒后移至鼠笼常规饲养。造模时间为3个月。

1.2.4 行为学检测[6-7]：行为学试验前将小鼠提前运至行为学实验室专用笼架适应3 h左右，以减轻动物应激和紧张情绪。旷场试验中，将小鼠放于旷场实验箱（40 cm×40 cm）中央，箱子的上方安装有与行为学记录分析系统相连接的摄像机，记录小鼠在实验箱中的运动轨迹。采集分析小鼠自由探索5 min内的总运动距离，反映小鼠的运动能力。悬挂试验使用一个铺有柔软垫料的大鼠笼和笼盖，固定笼盖，高度定为25 cm以上。把小鼠放在笼盖上，使其爪抓住笼盖杆，翻转笼盖，使其四爪抓住盖杆倒挂，迅速开始计时；小鼠从杆上掉下，结束计时，记录悬挂持续时间，反映小鼠的肌力和平衡协调能力。每只小鼠重复3次，取最大值作为小鼠的测试结果，试验时间不超过10 min。Y迷宫试验中，标记Y迷宫三个臂分别为A、B、C，将小鼠置于A臂末端，让小鼠在Y迷宫内自由探索5 min。记录小鼠依次进臂的顺序，统计正确的轮替次数（依次进入三个不同的臂）以及总的轮替次数，两者比值即为自发交替正确率，作为评价小鼠工作记忆的指标。

1.2.5 免疫组织化学染色[7]：造模后的小鼠经过灌注取脑、固定及脱水等一系列预处理后进行SNpc区冠状位冰冻切片，切片厚度30 μm，存放于4 ℃冰箱的冰冻保存液中备用。脑片室温复温漂洗，免疫染色抗体稀释液1∶1000稀释一抗（pSyn、TH及IBA-1抗体），室温慢摇孵育过夜。用免疫染色抗体稀释液1∶1000稀释生物素标记二抗，室温孵育1 h。用ABC复合物室温孵育1 h后将脑片黏附到载玻片上，每张切片滴加新鲜配制的DAB显色溶液，显微镜下观察，控制染色时间5～20 min。苏木素复染细胞核45 s后，切片室温下晾干、梯度脱水、中性树胶封片晾干后在显微镜下拍摄。

1.3 统计学处理方法 采用Image J软件测量SNpc脑片中免疫组织化学染色图片包含阳性信号的细胞百分比或阳性细胞数量，每只小鼠挑选3张脑片（前中后各一张），求其平均值。试验数据采用SPSS16.0软件进行统计分析，并以±s的形式表示。方差齐性检验采用Levene检验，2组样本均数比较采用独立样本t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 A53T αS原纤维PD小鼠模型的行为学表型 旷场试验中，模型组小鼠5 min内的总运动距离较对照组小鼠差异无统计学意义（P＞0.05），表明模型组小鼠尚未出现运动功能的改变。悬挂试验显示模型组小鼠四爪抓杆持续时间较对照组显著缩短，差异有统计学意义（P＜0.05），提示模型组小鼠肌力和平衡协调能力下降。Y迷宫检测表明模型组小鼠的自发转换正确率与对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05），表明模型组小鼠未出现工作记忆认知功能的改变。见表1。

表1 A53TαS原纤维PD小鼠模型的行为学表型（每组n=10，±s）

表1 A53TαS原纤维PD小鼠模型的行为学表型（每组n=10，±s）

组别 旷场试验总运动距离（cm） 悬挂试验四爪抓杆持续时间（s） Y迷宫实验自发转换正确率（%）对照组 4221.8±339.8 315.0±46.6 66.9±1.7模型组 4052.7±169.1 194.9±26.0 60.6±2.7 t 0.446 2.250 1.982 P 0.661 0.037 0.063

2.2 A53T αS原纤维PD小鼠模型的LBs病理分析

本研究以丝氨酸129位磷酸化的pSyn作为评估LBs包涵体的标记物。免疫组织化学染色显示在SNpc脑区注射位点附近可以观察到显著的LBs包涵体病理改变（见图1）。模型组小鼠SNpc脑区pSyn包涵体阳性的SNpc区细胞百分比为（35.60±3.93）%，显著高于对照组的（4.22±0.27）%，差异有统计学意义（t=7.964，P＜0.001）。

2.3 A53T αS原纤维PD小鼠模型的DA能神经元定量分析 免疫组织化学染色结果表明，SNpc脑区注射A53T αS导致TH阳性神经元的丢失（见图2），模型组小鼠SNpc脑片中可清晰定量的TH阳性神经元数量为（59.78±4.23）个，显著低于对照组的（87.13±3.71）个，差异有统计学意义（t=4.807，P＜0.001）。

图1 pSyn免疫组织化学染色图

图2 TH免疫组织化学染色图（×10）

2.4 A53T αS原纤维PD小鼠模型的神经炎症分析 IBA-1免疫组织化学染色结果显示，SNpc脑区注射A53T αS导致小胶质细胞的过度激活，激活的小胶质细胞胞体增大、突起变短、细胞形态呈圆形或杆状（见图3）。模型组小鼠活化小胶质细胞相对数量（1.13±0.17）为对照组（2.78±0.23）的2.78倍，差异有统计学意义（t=5.685，P＜0.001），提示模型组小鼠SNpc脑区存在过度的神经炎症。

3 讨论

以αS的异常聚集和扩散为分子标志的LBs脑内传播是PD的病理标志，为解释PD的运动及非运动症状提供了较好的理论模型，也为建立基于αS的PD动物模型提供了理论基础[8]。现有的基于αS的PD动物模型中，αS转基因小鼠PD模型可以较好地模拟脑内αS聚集及LBs传播扩散的病理进程，但大部分转基因动物中未发现SNpc区DA能神经元丢失这一典型病理标志[9]。重组腺相关病毒介导的αS过表达PD模型存在病毒载体纯化要求高的难题，且在模拟PD病理进展上存在缺陷[10]。基于αS原纤维的PD病理传播模型较好地克服了以上2种模型的不足，可全面模拟出PD主要病理特征。研究人员可通过向健康动物脑内直接注射包含αS病理的PD患者尸检或老龄αS转基因小鼠的脑组织匀浆[11]，或将体外重组表达并纯化的αS蛋白制备成原纤维后直接脑内注射造模[6]。这种基于αS原纤维的PD模型的原理是利用错误折叠的αS可在细胞间传播，并触发正常内源性αS由α螺旋向β折叠的构象转变的特性，最终导致PD进行性神经退行性变的启动和病理进展[12]。因此，基于αS原纤维的PD模型在研究αS病理传播机制中具有独特的优势。

图3 IBA-1免疫组织化学染色图

本实验利用小鼠脑内SNpc定位注射突变型A53T αS原纤维的方法，成功地建立了αS原纤维PD小鼠模型，同时模拟出LBs包涵体、DA能神经元丢失及神经炎症三大PD病理特征。行为学检测结果显示，模型组小鼠表现出显著的肌力减弱及平衡力下降。LUK等[6]在小鼠的背侧纹状体区注射αS原纤维，造模30 d时通过悬挂实验就能检测到实验组小鼠的肌力及协调能力减弱。本实验中模型小鼠尚未出现运动及认知功能的显著下降，这与LUK等[6]的研究结果不一致，推测可能是因为纹状体DA水平尚未明显下降（纹状体脑区TH免疫组织化学结果表明，DA能神经元末梢尚未出现结构异常，数据未显示），也可能是本实验中的旷场试验检测不够灵敏，需要加大样本量。另外，本研究团队曾在前期报道过在海马区注射A53T αS原纤维可导致小鼠工作记忆的受损[7]，这与本研究结果不一致，原因可能是A53T αS原纤维直接注射到中脑SNpc区3个月时间尚不足以扩散到海马和皮层等与认知密切相关的脑区，或虽有少量扩散，但不足以影响到其神经网络功能的完整性。因此，αS原纤维注射到不同的脑区可能出现αS病理的传播差异，从而导致不同的行为学表型，说明了αS病理和行为学表型之间的密切联系。

PD患者的LBs中有90%以上为丝氨酸129位磷酸化的αS阳性包涵体，而在正常人的脑内仅有4%的αS有此位点的磷酸化[13]，因此，本研究以丝氨酸129位磷酸化的pSyn作为检测LBs包涵体的病理标记物。本实验中A53T αS原纤维诱导的LBs包涵体的形态呈多样性变化，有典型的强免疫活性的球形包涵体形式、纺锤丝样神经突形式以及大量规则不一的微粒状形式，这与KUUSISTO等[14]的研究结论一致，反映了A53T αS聚集程度的不同。此外，本研究发现直接在SNpc区注射A53T αS原纤维3个月可导致约30%的DA能神经元丢失，进一步证实了LBs和DA能神经元变性之间的因果联系。LUK等[6]发现纹状体区注射αS原纤维3个月和6个月后，αS病理可扩散到SNpc区，并分别导致DA能神经元死亡15%和35%；且发现αS原纤维诱导的LBs包涵体出现在DA能神经元死亡之前，同样证实了两者的因果关系。不同之处在于，本实验采用的是比αS原纤维毒性更强的突变型A53T αS原纤维，且直接注射在SNpc区，因而能够更快地导致更多的DA能神经元死亡。此外，研究表明PD尸检脑内有明显的神经炎症反应，主要包括小胶质细胞的过度激活及形态功能改变等；和SACINO等[15]的研究结果一致，我们同样发现A53T αS原纤维导致了以小胶质细胞活化为特征的神经炎症的过度激活。

总之，本实验利用SNpc区定位注射的方法建立了基于A53T αS原纤维的PD小鼠模型，证实了该模型可较为全面地模拟PD表型和病理特征，为进一步研究PD的病理机制及靶向αS的药物筛选提供前期基础。但是，A53T αS原纤维对DA能神经元毒性的分子机制，以及A53T αS在DA能神经元及胶质细胞内的吸收、分泌和扩散机制尚需深入研究。