血浆长链非编码RNA HOTTIP、ATB和MIAT在乳腺癌中的临床价值研究

侯玉兰，朱黎黎，汪志学，常 琳△

(1.重庆市璧山区人民医院检验科,重庆 402760；2.重庆医科大学附属第二医院检验科，重庆 402760)

乳腺癌是当今危害女性健康的第一大肿瘤，其发病率居女性恶性肿瘤之首[1]。目前我国乳腺癌发病率为21.6/10万，较10年前增长了近一倍[2]。近年来随着医疗水平的提高，乳腺癌的总体五年生存率有所提高，但某些分子类型乳腺癌的预后仍不尽如人意，尤其是基底细胞型乳腺癌[3]。乳腺癌的预后取决于其分子类型与TNM分期，寻找可靠、稳定且无创的早期筛查指标无疑可为乳腺癌患者的治疗赢得时间，对预后的提供具有重要意义。近年来研究发现，多种长链非编码RNAs(lncRNAs)在乳腺癌患者中存在异常表达，可通过表观遗传、转录及转录后翻译等多种途径参与乳腺癌的发生、发展及侵袭转移等过程[4]，这些lncRNAs包括lncRNA HOTTIP、ATB和MIAT等。本研究通过对245例乳腺癌患者与250例健康女性的血浆lncRNA HOTTIP、ATB和MIAT表达水平进行比较分析，旨在探究三者对乳腺癌的诊断价值及其与乳腺癌临床病理特征之间的关系，以期为乳腺癌的临床诊疗提供新思路。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2014年3月至2017年12月在重庆市璧山区人民医院初次确诊的乳腺癌患者245例(病例组)。病例组纳入标准为：(1)经CT结合病理学确诊为乳腺癌；(2)入院前未经治疗。其中Luminal A 型83例、Luminal B型 81例、人类表皮生长因子受体2(HER2)过表达型33例、基底细胞型48例，Ⅰ～Ⅱ期乳腺癌137例、Ⅲ～Ⅳ乳腺癌108例。患者平均年龄(45.56±3.23)岁。乳腺癌分子分型的依据来自术中切除的肿瘤组织的免疫组化结果。乳腺癌的分期参照美国肿瘤联合会(AJCC)第8版乳腺癌分期系统[5]。对照组为同期在本院行体检的健康女性250例，平均年龄(44.87±3.76)岁。由研究人员记录两组研究对象的年龄、体质量指数(BMI)、吸烟史、饮酒史等基本信息。所有研究对象均排除乳腺良性结节、血液系统疾病、急慢性感染、心血管疾病、其他的良恶性肿瘤及自身免疫性疾病等。本研究的开展经医院伦理委员会批准，所有纳入对象均签署了项目知情同意书。

1.2血浆 lncRNA HOTTIP、ATB和MIAT表达水平检测 研究对象均禁食10 h以上，次日清晨由专业医护人员使用乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝采血管抽取静脉血10 mL，血液标本在1 h内于4 ℃条件下以12 000 g离心力离心15 min以去除血细胞。收集上层液体，按照血浆RNA提取试剂盒(中国Bioteke公司)说明书步骤进行血浆总RNA提取。取上述提取的RNA，使用去除基因组逆转录试剂盒(中国Takara公司)逆转录为cDNA。采用实时荧光定量PCR(qPCR)法检测血浆lncRNA HOTTIP、ATB和MIAT及内参基因GAPDH表达水平。反应体系为：Mix 10 μL，上下游引物各0.8 μL，cDNA 2 μL，DEPC水6.4 μL。荧光定量PCR循环条件：95 ℃变性5 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，45个循环，每组设置2个复孔。检测过程中所用引物序列如下：HOTTIP上游引物：5′-AGT GTG TCA TAG AGC TTC CTG TTT CAT CTC CCA GT-3′下游引物：5′-TGG AAC CAG GCC CCA GGG AAT CTT TCA GCT GCA TT-3′；ATB 上游引物：5′-TAC AAC CAC TGC ACT ACC TG-3′，下游引物：5′-TGG AAT GCT TGA AGG CTG CT-3′； MIAT上游引物：5′-CGA ACG AGA GGA CCG AAG-3′，下游引物：5′-GCC AAG TTC TAG ATA AGC -3′；GAPDH 上游引物：5′-GGG AGC CAA AAG GGT CAT-3′，下游引物：5′-GAG TCC TTC CAC GAT ACC AA-3′；采用2-ΔΔCt法计算lncRNA HOTTIP、ATB和MIAT的相对表达量，△Ct值=目的基因Ct值-GAPDH Ct值。

2 结 果

2.1两组研究对象的基本临床信息 研究对象的基本临床信息见表1。病例组与对照组在年龄、BMI、吸烟史、饮酒史等方面的差异均无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

表1 病例组和对照组临床基本信息的比较

2.2两组研究对象的血浆 lncRNA HOTTIP、ATB和MIAT表达水平 病例组的血浆lncRNA HOTTIP、ATB和MIAT表达水平均高于对照组，且差异具有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 病例组和对照组血浆lncRNA HOTTIP、ATB和MIAT相对表达水平的比较

2.3血浆 lncRNA HOTTIP、ATB和MIAT表达水平与乳腺癌患者临床病理特征之间的关系 血浆lncRNA HOTTIP、ATB和MIAT表达水平与乳腺癌患者的年龄、BMI、吸烟与否、饮酒与否等因素无关(P>0.05)，而与乳腺癌的TNM分期、分子分型显著相关(P<0.05)。见表3。

表3 血浆 lncRNA HOTTIP、ATB和MIAT表达水平与乳腺癌患者临床病理特征之间的关系(-log)

2.4ROC曲线分析 ROC曲线分析显示，血浆lncRNA HOTTIP、ATB、MIAT在区分乳腺癌与健康人群的AUC分别为：0.784(95%CI：0.701～0.866，P<0.001)、0.887(95%CI：0.822～0.951，P<0.001)、0.913(95%CI：0.855～0.971，P<0.001)，灵敏度和特异度分别为：63.8%/89.3%、79.7%/91.7%、87.1%/92.8%。当联合血浆lncRNA HOTTIP、ATB、MIAT时，区分食管癌与健康人群的AUC为0.977(95%CI：0.902～0.998，P<0.001)，灵敏度为85.5%，特异度为97.6%，见图1。

2.5风险评估 多元Logistic回归分析结果，见表4。单因素分析显示，血浆高lncRNA HOTTIP、ATB、MIAT水平是乳腺癌发病的危险因素(P<0.05)；多因素分析显示，在校正年龄、BMI、吸烟史、饮酒史等因素的影响后，血浆高lncRNA HOTTIP、ATB、MIAT水平仍是乳腺癌发病的独立危险因素(P<0.05)。

图1 ROC曲线分析

单因素分析OR(95%CI)P多因素分析OR(95%CI)PHOTTIP1.32(1.09～2.31)0.0371.12(1.03～1.34)0.048ATB4.61(2.18～7.33)<0.0014.77(1.47～6.08)<0.001MIAT5.38(1.39～8.91)<0.0013.51(1.53～5.72)0.001

3 讨 论

乳腺癌是全球女性最常见的恶性肿瘤，约占女性全部恶性肿瘤的22.9%，严重威胁女性身心健康[6]。中国女性的乳腺癌发病率虽低于全球发病率，但随着近年来人们生活方式及生育观念的改变，乳腺癌的发病率有逐年增高趋势[7]。目前乳腺癌的治疗效果并不乐观，采用的主要治疗方式包括单纯手术治疗、抗肿瘤药物治疗及放射治疗[8]。晚期患者接受手术治疗后，虽可提高患者的五年生存率，但却严重影响了女性的后期生活，甚至对女性心理健康也造成了一定的影响[9]。由于乳腺癌治疗方式的选择及预后主要取决于肿瘤的TNM分期与分子分型[7,10]，而目前尚无可靠的早期筛查生物学指标，因而寻找有效、稳定且无创的早期筛查指标对改善患者生存质量，提高患者预后具有重要意义。

近年来，关于lncRNAs在乳腺癌领域的相关功能学研究逐渐成为新的热点。目前已经发现了近10种lncRNAs与乳腺癌细胞的增殖、凋亡、迁移、侵袭等过程有关。例如，YANG等[11]对460例乳腺癌患者的一项荟萃分析结果表明，lncRNA HOTTIP表达水平与肿瘤直径、淋巴结转移状态、TNM分期等密切相关，且高水平的lncRNA HOTTIP提示更差的临床预后。随后研究发现其可能的机制lncRNA HOTTIP可诱导肿瘤组织高表达HOXA11，从而促进肿瘤细胞的侵袭转移[12]。LncRNA ATB也被证实参与乳腺癌的发病过程。SHI等[13]利用永生化乳腺癌细胞系进行体外实验的结果表明，LncRNA ATB可通过TGF-β途径诱导上皮间质转化，进一步促进乳腺癌细胞的耐药，并增强其侵袭能力。NIKPAYAM等[14]对50对乳腺癌及癌旁组织中LncRNA ATB的表达进行比较分析发现，癌组织中LncRNA ATB表达水平显著高于癌旁组织，提示LncRNA ATB对鉴别诊断乳腺癌具有潜在价值。除lncRNA HOTTIP与ATB外，近年来关于LncRNA MIAT与乳腺癌的研究也有一定进展。例如，LUAN等[15]的体外实验证实，LncRNA MIAT可作为内源竞争RNA取代miR-155-5p并上调DUSP7表达，进而促进乳腺癌的发病。ALIPOOR等[16]发现，LncRNA MIAT在乳腺癌等多种肿瘤组织中均呈高表达状态，而靶向抑制LncRNA MIAT则可促进乳腺癌细胞凋亡，并降低其迁移能力。上述研究结果提示，lncRNA HOTTIP、ATB和MIAT可通过多种途径参与乳腺癌的发病过程，而三者的异常表达可能为乳腺癌的早期诊断提供线索，但目前国内外尚无关于上述3种LncRNAs与乳腺癌诊断的相关报道。

在本次研究中，首次探究了血浆lncRNA HOTTIP、ATB和MIAT对乳腺癌的诊断价值，并分析了三者与乳腺癌临床病理特征之间的关系。研究结果表明，联合三项指标诊断乳腺癌的特异度高达97.6%，显著高于单项指标灵敏度，表明联合检测血浆lncRNA HOTTIP、ATB和MIAT诊断乳腺癌具有可行性，可考虑在临床推广使用。此外，本研究再次证实，lncRNA HOTTIP、ATB和MIAT表达水平与乳腺癌的分子类型、TNM分期显著相关，该结论与前期国外研究结果相一致，表明lncRNA HOTTIP、ATB和MIAT表达水平对乳腺癌的预后具有一定预测作用。由于本次研究收集的样本数量有限，未来仍需更多大样本多中心研究对本研究的结论进行验证。

4 结 论

本研究发现血浆lncRNA HOTTIP、ATB和MIAT对乳腺癌的诊断、发病风险评估及预后评估中具有潜在价值，有望为乳腺癌的临床诊疗提供新思路。