HIF-1α介导大鼠血管内皮细胞ET-1及其受体表达的机制研究

孟承颖，胡德林，余又新，周舜英， 梁 荣，段声梁，蒋智永，蒋 薇，王 欢，孙业祥，方林森

血管内皮细胞早期损害主要表现为血管通透性增加，这是血管内皮细胞损害后早期组织水肿、体液外渗的重要病理生理基础[1]。血管通透性增加引起一系列病理生理改变，如组织器官的缺血低氧、烧伤隐匿性休克等，其中缺血低氧是最早出现的病理生理改变[2]。研究[3]显示，大量的转录因子参与低氧条件下细胞及机体的各种反应，其中低氧诱导因子-1(hypoxia inducible factor-1, HIF-1)被认为是最重要的转录因子，HIF-1广泛存在人体的组织和细胞内，是由HIF-1α和HIF-1β组成的异源二聚体，其生物活性主要由HIF-1α亚基决定。HIF-1α亚基是氧调节蛋白，被称为“低氧基因表达的总开关”，对氧浓度高度敏感，研究[4]表明，低氧刺激下HIF-1α mRNA的表达水平可显著上调，并增加HIF-1α蛋白的表达水平和稳定活性，随着氧浓度增加，HIF-1α蛋白会快速降解，而HIF-1β则对氧浓度的敏感性较低，其表达与低氧与否关系不明显。

研究[5]显示，HIF-1调控的信号途径及蛋白表达可能是造成血管通透性增加的潜在因素。HIF-1介导的相关基因主要包括血管内皮生长因子(VEGF)、血管新生基因、内皮素-1(endothelin-1, ET-1)、磷酸果糖激酶等能量代谢基因等，其中介导ET-1及其受体的作用近年来已经成为研究的热点。主要由血管内皮细胞合成和分泌的ET-1是一种缩血管的多肽类物质，其产生由多种因素影响。研究[6]显示，ET-1的分泌受内皮细胞的缺血低氧强烈刺激，并且会进一步加重局部和全身循环的损害。由此可见，HIF-1可能通过介导ET-1的表达水平而发挥对低氧应激刺激的反应。该实验将通过大鼠血管内皮细胞体外培养，建立单层血管内皮细胞模型，运用质粒过表达或siRNA干扰技术建立HIF-1α高表达和HIF-1α低表达，应用Real-time PCR、Western blot法检测HIF-1、ET-1、内皮素受体A(endothelin receptor A，ETA)、内皮素受体B(endothelin receptor B，ETB)的mRNA和蛋白表达水平，明确HIF-1α在介导血管内皮细胞中ET-1及其受体表达中的作用及机制，为防治创伤后血管通透性增加提供可借鉴的依据。

1 材料与方法

1.1主要材料TRIzol试剂、PCR试剂盒、DNA Marker、反转录试剂盒、ECL超敏发光试剂盒(美国Thermo Fish公司)；引物用Primer Premier 5.0软件设计(由上海生工技术有限公司合成)；荧光定量PCR试剂、光谱彩虹预染蛋白Marker、山羊抗小鼠IgG(CW0102)、山羊抗兔IgG(CW0103)、兔抗山羊(CW0105)(北京康为世纪生物科技有限公司)；RIPA细胞裂解液(强)、BCA蛋白质定量试剂盒、Western blot聚丙烯酰胺凝胶试剂盒、RPMI1640培养基、新生小牛血清、0.2 μm和0.45 μm PVDF膜、GV230质粒(上海吉凯基因化学技术有限公司)。根据GenBank中的HIF-1α(NM_024359)基因编码序列，参考siRNA的设计原则，设计并合成shRNA，利用Ambion公司siRNA在线设计软件分别在3个与HIF-1α无同源性的插入序列形成发夹，最后为siRNA作用链的反向重复序列。Agel和EcoR I酶切位点在合成的DNA两端分别引入(上述3条寡核苷酸链由上海吉凯基因公司合成)。

1.2方法

1.2.1大鼠血管内皮细胞的原代培养 取清洁级SD大鼠主动脉放入D-Hanks液中，清洗干净暴露的内膜面。用含0.1%胶原酶溶液使血管内皮细胞离散下来，然后酶的作用被等量的含10%小牛血清的RPMI1640培养液终止。收集消化后的酶溶液离心，弃上清液，留取内皮细胞悬浮液。用RPMI1640培养液在5% CO2、37 ℃条件下培养，3～4 d更换培养液，待细胞生长至80%～90%融合时，用0.25%胰蛋白酶消化传代，3～5代细胞用于下一步实验。

1.2.2细胞转染

1.2.2.1GV230质粒转染至大鼠血管内皮细胞 过表达实验分为三组：空白组、GV230组、GV230/HIF-1α组。转染前将PCR扩增后的大鼠HIF-1α基因与GV230质粒载体连接形成重组质粒，提取并鉴定，形成HIF-1α高表达细胞系。转染的具体操作为：分别将20 pmol的HIF-1α真核表达载体溶解于终体积为50 μl的cDNA Transfection中涡旋5 s和2.6 μl转染试剂稀释到终体积为50 μl的cDNA Transfection Buffer中涡旋10 s。将稀释好的转染试剂加入到核酸溶液中，涡旋3 s，室温孵育15 min。900 μl培养基加入上述复合物中，吹打混匀。吸弃原有细胞培养基，用无菌PBS洗涤细胞3次，然后加入上述混合好的培养基，细胞培养箱中继续培养，6 h后更换为含筛选抗生素的培养基。

1.2.2.2GV248质粒转染至大鼠血管内皮细胞 siRNA干扰实验分为：空白组、shRNA-NC组、shRNA/HIF-1α组(包括1、2、3个干扰序列)。转染前需要首先设计和合成shRNA，连接shRNA与质粒GV248，并转化大肠杆菌JM109，筛选出有效的重组质粒，形成HIF-1α低表达细胞系。转染的具体操作与1.2.3.1相同。

1.2.3Real-time PCR 检测过程 应用TRIzol试剂提取细胞总RNA，以总RNA为模板合成cDNA第一链；以cDNA为模板，使用ABI7500 Real-time PCR仪检测各组细胞HIF-1α、ET-1、ETA、ETB的基因表达。Real-time PCR反应程序为：95 ℃，5 s；60 ℃，34 s，设置循环数为40。以β-actin作为内参，采用2-ΔΔCt法比较分析各基因表达，引物序列及扩增产物长度见表1。

表1 PCR引物序列及扩增产物长度

1.2.4Western blot检测 采用RIPA细胞裂解液提取细胞总蛋白，使用BCA法进行各组总蛋白定量，按50 μg/孔的量加样、SDS-PAGE电泳、转膜、封闭。然后，参考说明书进行一抗孵育、二抗孵育，4 ℃孵育过夜，TBST洗膜3次，每次5 min。相应二抗室温孵育1.5 h，3次TBST洗膜，每次10 min。最后，使ECL试剂盒在PVDF膜上显色曝光。采用Quantity one灰度分析软件分析目的蛋白灰度值，以β-actin为内参计算其相对表达量。

1.3统计学处理采用GraphPad Prism 5.0软件对结果进行统计处理，采用描述数据的集中趋势，应用单因素的方差分析比较多组之间均数的差异，各组之间的两两比较采用LSD法，以P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1大鼠血管内皮原代细胞培养结果图1为大鼠血管内皮原代细胞培养1～4 d的结果。镜下可见细胞向四周伸出细长的突起，部分细胞间出现连接，细胞呈现“多角形”，细胞核呈椭圆状。

2.2HIF-1α的过表达及干扰效果分析HIF-1α过表达后，空白组、GV230组、GV230/HIF-1α组之间HIF-1α的mRNA(F=11.983,P=0.003)和蛋白表达水平(F=23.015,P<0.001)差异有统计学意义。LSD两两比较结果显示，GV230/HIF-1α组的HIF-1α的mRNA和蛋白表达水平显著高于空白组和GV230组，差异有统计学意义(P<0.05)，而空白组和GV230组之间差异无统计学意义(P>0.05)。反之，siRNA干扰后空白组、shRNA-NC组、shRNA/HIF-1α组之间HIF-1α的mRNA(F=31.992,P<0.001)和蛋白表达水平(F=10.850,P=0.004)差异有统计学意义。shRNA/HIF-1α组的HIF-1α的mRNA和蛋白表达水平显著低于空白组和shRNA-NC组，差异有统计学意义(P<0.05)，而空白组和shRNA-NC组之间差异无统计学意义(P>0.05)，见图2。

图1 大鼠血管内皮原代细胞培养1～4 d的结果 ×400

2.3HIF-1α介导血管内皮细胞ET-1及其受体表达分析与空白组和GV230组相比，GV230/HIF-1α组的细胞中ET-1、ETA、ETB mRNA和蛋白表达水平显著增高，差异有统计学意义(P<0.05)；而空白组和GV230组相比ET-1、ETA、ETB mRNA和蛋白表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。反之，与空白组和shRNA-NC组相比，shRNA/HIF-1α组的细胞中ET-1、ETA、ETB mRNA和蛋白表达水平显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)；而空白组和shRNA-NC组相比ET-1、ETA、ETB mRNA和蛋白表达水平差异无统计学意义(P>0.05)，见表2、图3。

3 讨论

本研究主要证实了HIF-1α可介导血管内皮细胞中ET-1、ETA、ETB mRNA和蛋白表达水平，即转载HIF-1α高表达质粒的血管内皮细胞中ET-1、ETA、ETB mRNA和蛋白表达水平都显著增加，反之转载HIF-1α低表达质粒的血管内皮细胞中ET-1、ETA、ETB mRNA和蛋白表达水平都显著降低。本研究结果提示HIF-1α/ET-1可能是人体内组织细胞低氧条件下的一个重要调节通路，参与调节人体许多重要的生理过程。

HIF被认为是介导机体低氧反应的重要转录因子，可以对机体低氧状态进行适应调节，调控低氧反应基因的表达。HIF主要在低氧环境下活化，同时在富氧环境下降解。低氧刺激下，HIF-1α与HIF-1β以二聚体的形式在细胞核内与目的基因的某个结合位点结合而参与基因的转录调控，这是低氧应激反应的最重要的一个环节[7]。

ET-1是迄今为止发现的最强的内源性血管收缩肽，是HIF-1α下游靶基因。研究[8]显示，ET-1启动子区域存在HIF-1的结合位点，在低氧环境下与HIF-1α特异性结合，激活内皮细胞ET-1，使ET-1表达增加，从而会进一步激活ETA和ETB受体，可能会导致细胞和线粒体内的钙超载，钙超载会导致细胞膜上的G蛋白磷酸化，进而导致细胞内cAMP升高，最终导致细胞凋亡。同时，ET-1浓度升高造成血管进一步收缩，这会导致机体缺血低氧加重，进而形成级联反应造成机体损伤加重[9-11]。

表2 HIF-1α介导血管内皮细胞ET-1及其受体mRNA表达和蛋白表达水平

图2 HIF-1α的过表达及干扰后内皮细胞HIF-1α mRNA和蛋白表达水平

HIF-1α/ET-1通路在许多疾病的发生发展中发挥重要生理病理作用。研究[12]显示，烧伤会损害血管内皮细胞，引起血管通透性改变，这是烧伤早期组织水肿、体液外渗的重要病理生理基础。在烧伤的过程中，内皮细胞会出现严重的缺血低氧，在低氧应激下HIF-1α/ET-1的表达显著增高，ET-1引起血管进一步收缩，进而加重局部和全身循环的损害[8]。研究[13]表明，糖尿病妊娠患者胎盘组织HIF-1α/ET-1表达参与了妊娠结局的发生、发展，临床治疗中应关注以HIF-1α/ET-1为靶点的抗糖尿病并发症治疗，积极改善预后。妊娠期糖尿病患者由于血糖升高导致胎盘血管病变，滋养细胞功能异常及绒毛间质纤维化从而引起胎盘缺血低氧，进而刺激胎盘HIF-1α/ET-1通路的过度表达，引发胎盘滋养细胞的应激化反应导致胎盘局部损伤，这可能是妊娠期糖尿病患者不良妊娠结局的风险增大的一个重要原因[14]。此外，ET-1表达增加也可能会引起血管内皮细胞功能障碍和氧化应激，对患者的血液微循环及流变性造成一定影响，容易导致患者出现缺血、低氧甚至水肿等并发症。由于ET-1主要分布于心血管内皮细胞系统，因此HIF-1α/ET-1与心脑血管疾病的发生发展也存在必然的联系，例如心力衰竭、冠状动脉疾病、原发性高血压、动脉粥样硬化、肺动脉高压、脑梗死等[15]。

HIF-1α/ET-1在血管相关的病理生理学中具有重要的作用，其表达水平包括受体的循环水平和动态平衡变化可以影响很多疾病的发生和发展过程，而且它可以在其合成、受体结合或者胞内信号传导等各个节点受到其他因子的调控作用。ET-1受体拮抗剂可缓解血管炎症，降低血管平滑肌细胞分化、钙化。因此，以HIF-1α/ET-1为靶点的ET-1受体拮抗剂将会是一类很有前途的新型药物，有望在血管相关疾病的防治方面起到特殊作用。

图3 HIF-1α的过表达及干扰后内皮细胞ET-1、ETA、ETB蛋白表达变化情况