转录因子GRHL3抑制SNX16表达促进乳腺癌细胞迁移和侵袭

周利利，曾凡军，涂珍珍，郭立钰，郭思佳，邓庆梅，周海胜,2

转录因子GRHL3作为Grainyhead家族成员之一，在胚胎发育过程中，参与调控上皮细胞的分化和迁移[1-2]。GRHL3基因敲除小鼠因神经管闭合缺陷和皮肤表皮屏障缺少而致死[3-4]。对于GRHL3调控肿瘤细胞发生迁移和侵袭的靶基因，目前报道较少。分拣连接蛋白16(Sorting Nexin 16，SNX16)属于SNXs蛋白家族成员，分布于胞外基质连接的粘着斑。过去研究[5]显示增加SNX16的表达能够 抑制乳腺癌细胞的迁移和侵袭，其机制是与SNX16调控E-cadherin的回收再利用有关。

为证实SNX16是GRHL3调控的靶基因并研究其对乳腺癌细胞迁移和侵袭能力的影响，拟利用免疫组织化学方法分析GRHL3和SNX16在乳腺癌组织中表达关系；利用低侵袭能力的乳腺癌细胞株MCF7，过量表达GRHL3后分析SNX16的表达变化及MCF7细胞迁移和侵袭变化，初步探讨GRHL3调控SNX16表达的机制。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1组织标本 人乳腺癌组织标本由中国科学院合肥肿瘤医院及达安医学检验中心病理科提供，其中乳腺侵袭性导管癌标本18例，乳腺侵袭性导管癌癌旁组织标本10例，正常乳腺组织标本2例。

1.1.2细胞系 人乳腺癌细胞系MCF7和人胚胎肾细胞系293T由海胜实验室保存；稳定过量表达GRHL3的MCF7细胞系由海胜实验室构建。

1.1.3载体 真核细胞表达载体pCMV-Tag-2B、用于检测启动子活性的荧光素酶报告基因载体pGL3-Basic、海肾萤光素酶报告基因载体pRL-TK载体购自美国Promega公司；克隆载体pMD-18T购自大连宝生物有限公司；过量表达GRHL3的表达载体pCMV-GRHL3、过量表达SNX16的表达载体pCMV-SNX16由海胜实验室构建。

1.1.4引物 用于PCR扩增人的SNX16 基因启动子DNA引物：P1：5′-AGAGAATGTCGATTTCCTGCCA-3′，P2：5′-TTAACCGCAGCTTTTCGCCT- 3′；用于对GRHL3第一个结合位点(Site 1)进行定点突变的PCR引物Prom1：5′-AGAGAATGTCGAcgacttCTGCCA-3′，用于对GRHL3第二个结合位点(Site 2)定点突变的PCR引物Prom2：5′-AGAGACTatctgattCGGGGAGCAGCTGCT-3′。Prom1和Prom2的序列中小写字母为突变位点序列。

1.1.5主要试剂 RPMI-1640培养基、高糖DMEM培养基和青霉素/链霉素(P/S)来自美国Hyclon公司；胎牛血清(FBS)购自美国Corning公司；转染细胞试剂Lipofectamine 3000购自美国Invitrogen公司；兔源抗SNX16抗体购自美国Novus Biologicals公司，鼠源抗GAPDH抗体和辣根过氧化酶(horseradish peroxidase，HRP)标记的二抗购自美国Santa Cruz公司；免疫组化二抗和免疫组化DAB显色剂试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司；BD基质胶和Boyden小室购于美国BD Biosciences公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养 MCF7细胞使用含10%胎牛血清和含1%的P/S的RPMI-1640培养基。细胞放置于37 ℃并含5% CO2的培养箱中培养。

1.2.2SNX16基因启动子克隆和定点突变 通过PCR克隆野生型的SNX16基因启动子-417 bp 到 +105 bp DNA片段，并插入pMD-18T载体测序。利用KpnI和XhoI双酶切将SNX16启动子亚克隆到pGL3-Basic载体上，构建pGL3-SNX16 Promoter-Luc重组载体；利用突变引物按如下条件进行PCR扩增：94 ℃、2 min，98 ℃、10 s，60 ℃、30 s，68 ℃、3 min；用DpnI消化模板质粒DNA。用T4多聚核苷酸激酶和DNA连接酶处理PCR产物，以进行自身环化。环化DNA转化感受态细菌，提取单个细菌克隆的质粒DNA进行测序。

1.2.3荧光素酶实验 将pGL3-Basic载体、重组载体pGL3-SNX16 Promoter-Luc以及3种突变载体与pRL-TK和pCMV-GRHL3 重组载体(或pCMV-Tag-2B空载体)按照Lipofectamine 3000试剂说明书操作，共同转染239T细胞，24 h后收集样品进行荧光素酶活性检测。

1.2.4Western blot实验 根据文献[6]方法，收集细胞总蛋白，进行聚丙烯酰胺-SDS电泳，待目的蛋白充分分离至不同位置后转移至PVDF膜上，室温封闭45 min，4 ℃过夜孵育一抗(1 ∶1 000)。HRP标记的二抗 室温孵育6～8 h，加入超敏底物溶液，暗室中显影和定影，拍照。

1.2.5Transwell迁移实验和侵袭实验 细胞侵袭实验将融化BD基质胶加入Transwell小室上层，晾干，静置过夜；细胞计数调整为2.0×105/ml，取200 μl加至上室，下室加600 μl 5% FBS培养基；甲醇固定20 min，苏木精染色10 min，洗涤，伊红染色2 min，冲洗后擦去上层细胞，制片，计数。细胞迁移实验过程与细胞侵袭实验相同，但在小室上层不添加BD基质胶。

1.2.6免疫组化 组织切片(4 μm)常规脱蜡入水后，微波热修复抗原，使用3% H2O2消除内源性过氧化物酶，山羊血清封闭，4 ℃孵育一抗(1 ∶100)过夜。第2天依次室温孵育通用二抗工作液聚合物，DAB显色，苏木精复染，最后组织经脱水透明后烘干封片。

2 结果

2.1免疫组化检测GRHL3、SNX16在乳腺癌组织表达免疫组化结果显示，GRHL3主要在乳腺癌组织的细胞核表达，胞质亦可见GRHL3染色；SNX16分布于正常乳腺组织导管上皮细胞质，而乳腺癌组织SNX16表达水平较低或不表达(图1)。18例癌组织标本中，14例(77.8%)显示GRHL3(+)、SNX16(-)，10例癌旁组织有8例显示GRHL3(+)、SNX16(-)；只有2例(11.1%)癌组织标本与正常乳腺组织均显示为GRHL3(-)、SNX16(+)(表1)。

表1 GRHL3和SNX16在乳腺癌组织和

2.2MCF7细胞GRHL3和SNX16的表达变化为了在细胞水平证实GRHL3与SNX16的负调控作用，选择低侵袭力的乳腺癌细胞株MCF7作为研究对象，建立稳定过量表达GRHL3的乳腺癌细胞株。将pCMV-GRHL3及其对应空载体pCMV-Tag-2B分别转染MCF7细胞。通过G418筛选分别获得过量表达GRHL3的MCF7/GRHL3细胞克隆和对照组细胞克隆MCF7/空载体。Western blot检测结果显示：MCF7/GRHL3细胞GRHL3的表达较对照MCF7/空载体细胞显著增加，而SNX16的表达明显降低(图2A)；与对照组MCF7/空载体细胞相比，MCF7/GRHL3细胞的GRHL3(P=0.022)和SNX16(P=0.002)的表达变化均具有统计学意义(图2B)。可见，GRHL3和SNX16的表达变化与乳腺癌组织表达变化一致。

图1 IHC检测乳腺组织中GRHL3和SNX16表达 ×200

2.3GRHL3抑制SNX16基因启动子活性分析已知GRHL3与靶基因启动子区域DNA特异序列TTTCC(T)或GGCT(A)GAGG结合(图3A)，抑制靶基因表达。通过生物信息学分析SNX16基因启动子DNA, 发现SNX16基因启动子区有2个GRHL3潜在结合位点：一号位点(Site 1)-408～-403 bp存在TTTCC(T)；二号位点(Site 2)+16 ～+23 bp存在GGCT(A)GAGG(图3B)。利用MCF7细胞基因组DNA为模板，PCR扩增获得SNX16基因启动子DNA(513 bp)，并亚克隆至pGL3-Basic，构建重组载体pGL3-SNX16 Promoter-Luc；利用PCR方法对一号位点和二号位点分别或同时进行定点突变。测序结果证实成功构建重组载体pGL3-SNX16 Promoter-Luc并实现定点突变(图3C)。从而构建含有3种突变的SNX16启动子荧光素酶报告基因的重组载体：一号位点突变的pGL3-SNX16 Promoter-Luc/m1、二号位点突变的pGL3-SNX16 Promoter-Luc/m2和两位点突变pGL3-SNX16 Promoter-Luc/m1+2。

为了探讨GRHL3对SNX16基因启动子的调控作用，将pGL3-SNX16 Promoter-Luc重组载体及3个突变的载体，联合pRL-TK分别与pCMV-GRHL3(或pCMV-Tag-2B)共转染293T细胞。24 h后检测各组相对荧光强度。结果显示：GRHL3对野生型SNX16基因启动子有明显的抑制作用(F=78.43，P=0.001)；一号位点(F=17.13，P=0.014)、二号位点(F=73.34，P=0.001)单突变的SNX16基因启动子在GRHL3作用下，仍然具有明显抑制作用；当一号位点与二号位点同时突变后，GRHL3没有显示SNX16基因启动子的抑制作用，无统计学意义(F=3.09，P=0.153)(图4)。

图2 MCF7细胞过量表达GRHL3抑制SNX16表达

图3 GRHL3结合DNA序列分析和SNX16基因启动子GRHL3结合位点突变

2.4GRHL3对细胞迁移和侵袭能力的影响为了研究过量表达GRHL3抑制SNX16表达可能影响乳腺癌细胞迁移和侵袭能力，通过瞬时转染pCMV-SNX16以回补SNX16的表达，进而进行Transwell细胞迁移和细胞侵袭实验。建立转染空表达载体的细胞系MCF7/空载体；转染过量表达GRHL3的细胞系MCF7/GRHL3；共转染过量表达GRHL3和SNX16的细胞MCF7/GRHL3+SNX16。Transwell迁移实验结果显示：转染空载体MCF7细胞的迁移细胞数为(13.3±2.07)，GRHL3过表达MCF7细胞的迁移细胞均数(93.17±9.56)，MCF7/GRHL3细胞在瞬时转染pCMV-SNX16以回补SNX16的表达，发生迁移的细胞数为(20.50±4.18)。经单因素方差分析三组间迁移能力,差异有统计学意义(P<0.001)。转染空载体的MCF7对照细胞与回补SNX16表达的MCF7/GRHL3细胞相比，迁移细胞数无统计学意义(P=0.184)(图5)。

Transwell侵袭实验结果显示：转染空载体的MCF7细胞发生侵袭细胞数为(10.83±1.72)，过表达GRHL3的MCF7细胞发生侵袭细胞数为(31.67±4.37)，过量表达GRHL3的MCF7/GRHL3细胞转染pCMV-SNX16后，发生侵袭的细胞数为(5.50±2.26)。经单因素方差分析三组间侵袭能力，差异有统计学意义(P<0.001)。其中过量表达GRHL3的MCF7细胞迁移能力最强，转染空载体的MCF7细胞迁移细胞数明显低于与过量表达GRHL3并回补SNX16的MCF7细胞侵袭细胞数，差异有统计学意义(P=0.023)(图5)。根据Transwell的迁移实验和侵袭实验，说明GRHL3过量表达促进MCF7细胞迁移和侵袭，且与GRHL3抑制SNX16表达有关。

图4 GRHL3调节SNX16基因启动子活性分析

图5 MCF7细胞迁移和侵袭

3 讨论

Grainyhead 家族高度保守，所编码的转录因子在胚胎发育过程中发挥关键的调控作用。GRHL3是其中的成员之一[1]。在小鼠发育过程中，GRHL3在伤口愈合、表皮形成及胚胎神经管闭合等过程中发挥重要作用[1-3]。GRHL3不仅在正常生长发育过程发挥重要作用，同时参与肿瘤发生发展过程。既往研究[7-8]表明，在早期乳腺癌中，尤其是非三阴乳腺癌中，GRHL3表达量升高，其机制是细胞对称分裂和肿块形成之间存在密切联系。在果蝇和小鼠体内，GRHL3调控多种参与表皮屏障形成及终末分化的基因表达[9]，近期研究[10]报道，敲除小鼠体内角质层形成细胞中GRHL3，可能诱发皮肤鳞癌的形成；基因表达谱分析显示GRHL3的表达与E-cadherin表达有抑制作用[11]；GRHL3通过直接或间接结合E-cadherin启动子上，抑制E-cadherin的表达，促进上皮来源肿瘤细胞的迁移和侵袭[11]。

为了探寻GRHL3调控与细胞迁移和侵袭的相关基因的表达，前期的染色质免疫共沉淀测序的结果发现SNX16可能是GRHL3调控的潜在靶基因(结果未示)。乳腺癌组织的免疫组织化学分析发现，GRHL3高表达的肿瘤组织中SNX16的表达明显降低；提示SNX16可能受到GRHL3的负调控。细胞水平研究进一步证实过量表达GRHL3时，SNX16的表达水平显著降低。通过生物信息学分析发现，SNX16基因启动子DNA序列存在GRHL3的潜在结合位点TTTCC(T)或GGCT(A)GAGG，与前期研究[5]发现的GRHL3结合E-cadherin基因启动子区域的特定序列5′-CACCTG-3′或5′-CAGGTG-3′均具有高度相似性。通过克隆SNX16基因启动子进行双荧光素酶实验，结果证实GRHL3对SNX16基因启动子的活性同样具有抑制作用，与GRHL3结合E-cadherin基因启动子抑制靶基因表达具有一致性。当对SNX16基因启动子区的GRHL3潜在结合位点进行突变，发现GRHL3无显著的抑制作用。因此GRHL3可能直接或间接通过结合于SNX16基因启动子，抑制SNX16表达。

以往研究[11]证实GRHL3过量表达可以抑制E-cadherin基因表达，进而促进肿瘤细胞的迁移和侵袭；SNX16的过量表达可以促进E-cadherin的回收再利用，而抑制乳腺癌细胞的迁移和侵袭[6-9]。在低侵袭力乳腺癌细胞MCF7中过量表达GRHL3，可以显著增加细胞的迁移和侵袭能力；当在过量表达GRHL3的细胞中转染SNX16 cDNA表达载体时，细胞的迁移和侵袭能力明显降低。因此，GRHL3既能抑制E-cadherin的表达又能抑制SNX16的表达，进而影响细胞迁移和侵袭。GRHL3作为核内转录因子，参与调控细胞迁移和侵袭的靶基因表达，进而改变细胞的迁移和侵袭能力。除了已经鉴定的GRHL3调控的靶基因SNX16和E-cadherin外，可能还参与调控其他靶基因的表达。发现和鉴定GRHL3调控的靶基因及其信号通路，从而探讨GRHL3在肿瘤细胞发生上皮-间质细胞转分化的核心转录因子SNAIL、ZEB1和TWIST等发生相互作用的方式[12]，为揭示GRHL3在肿瘤的迁移、侵袭和转移的分子机制具有重要的理论意义，也为干预肿瘤细胞的迁移和侵袭寻找新的治疗靶点具有应用价值。