反胶束法提取小米中蛋白酶条件的优化

付莉媛,代旭栋,张宇辉,付 俐,郭凯林,张弘弛,刘 瑞

(山西大同大学 生命科学学院，山西 大同 037009)

小米中的营养成分十分丰富，它不仅含有人体生长不可或缺的营养物质，而且还拥有一定的药用价值[1]。但目前人们对小米蛋白酶的提取研究较少，本实验采用反胶束提取法分离小米蛋白酶，旨在提高提取率，为后续对小米蛋白酶的研究提供参考。反胶束萃取法有着选择性高、容易放大、萃取液可循环利用、分离和浓缩同步进行等优点，特别适用于酶蛋白的分离[2]。并且反胶团可以保护酶蛋白分子，所以使用反胶束萃取可以有效减少提取过程有机溶剂对酶蛋白分子的损伤。而且反胶束萃取技术与传统的酶蛋白提取技术相比，它成本更低并且可以进行连续操作[3]。

1 材料

1.1 小米

小米,大同29号。

1.2 仪器与试剂

PHS-3C型pH计酸度计(上海仪电科技仪器股份有限公司)；XFB-200型小型粉碎机(吉首市中诚制药机械厂)；UV-3200S型紫外/可见分光光度计(上海美国谱达仪器有限公司)；AXTGL16M型台式高速冷冻离心机；JA5003B型千分之一电子天平(河南精密仪器仪表有限公司)。碱性蛋白酶(源叶生物，批号L19A6L1)；正辛烷、正己醇、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)；氯化钾；氢氧化钠；盐酸；所有试剂均为分析纯。

2 方法

2.1 提取小米蛋白酶

适量粉碎后的小米粉于烧杯，按料液比1∶10(质量体积)加入蒸馏水，搅拌提取60 min。4000 r/min离心20 min，待离心完成后取上清液即小米蛋白酶粗提取液。

2.2 制备标准曲线

将碱性蛋白酶粉末用0.1 mol/L的KCl溶液(pH值标定为11)分别配制成浓度为0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 g/L的酶溶液，然后以0.1 mol/L的KCl溶液(标定pH值为11)为空白对照，使用紫外/可见分光光度计在258 nm处对所有浓度的碱性蛋白酶溶液进行扫描，测量其吸光度值。

2.3 单因素实验

2.3.1 CTAB浓度(A)对提取效果的影响

将正辛烷与正己醇按照4∶1的比例配置成混合液，然后取适量CTAB粉末，配置成浓度为0.01，0.015，0.02，0.025，0.03 mol/L的反胶束溶液。小米蛋白酶粗提取液用浓度为0.10 mol/L的氯化钾溶液(pH值标定为11)稀释，得1.0 g/L小米蛋白酶溶液。然后酶溶液分别与上述不同CTAB浓度的反胶束溶液以1∶1的比例混合，并且振荡混匀5 min，使得萃取相充分萃取。待振荡结束后将浊液转移到50 mL离心管中，配平后3000 r/min离心4 min，然后取下相液，在258 nm波长下测量各样品的吸光度值。

2.3.2 正辛烷与正己醇的配比(B)对提取效果的影响

将正辛烷与正己醇分别按照以下比例配置成混合液：3∶1、3.5∶1、4∶1、4.5∶1、5∶1。取适量CTAB粉末，用不同配比的有机溶剂混合液分别配置成0.020 mol/L的反胶束溶液。小米蛋白酶溶液分别与有机溶剂配比不同的反胶束溶液以1∶1的体积比进行混合，后续步骤同上。

2.3.3 氯化钾溶液浓度(C)对提取效果的影响

用天平精确称取适量氯化钾晶体并用蒸馏水将其分别配置成浓度为0.05，0.075，0.10，0.125，0.15 mol/L的溶液(pH值标定为11)，然后用上述不同浓度的氯化钾溶液将小米蛋白酶粗提取液稀释为1.0 g/L蛋白酶溶液。将反胶束溶液与氯化钾浓度不同的小米蛋白酶溶液混合，并且振荡混匀5 min，使得萃取相充分萃取。后续步骤同上。

2.3.4 小米蛋白酶溶液与反胶束相溶液的配比(D)对提取效果的影响

用天平精确称取适量氯化钾晶体并用蒸馏水配置成浓度为0.10 mol/L的氯化钾溶液(pH值标定为11)，并用其稀释小米蛋白酶粗提取液，得到1.0g /L蛋白酶溶液。将反胶束相溶液与蛋白酶溶液分别按照不同的配比(3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3)混合(混合液体积固定)，并且振荡混匀5 min，使得萃取相充分萃取。后续步骤同上。

2.5 正交实验

根据单因素实验的结果，然后进行L9(34)正交试验，水平设置见表1，正交实验设计见表2。

表2 正交实验设计表Table 2 Orthogonal experimental designTable

3 结果与分析

3.1 标准曲线

使用origin软件对结果进行分析并得到标准曲线见图1，以及回归方程为Y=1.66189x+0.03052，(R=0.99812)，其中x为浓度(g/L)，Y为吸光度值。

图1 标准曲线Fig.1 Standard curve

3.2 单因素实验结果与分析

3.2.1 CTAB浓度对提取效果的影响

不同浓度的CTAB对提取小米蛋白酶的效果的影响见图2，从图2可以得知随着CTAB的浓度逐渐升高，提取液在258 nm处的吸光度值也逐渐升高，当吸光度值达到最大(1.913)时，CTAB的浓度为0.025 mol/L。当浓度再增加时，吸光度迅速下降。当CTAB浓度在一个比较低的范围内时，随着CTAB浓度的增大，反胶束体系中反胶团的形成也会增多，因而增溶酶蛋白的能力也会增强[4]。但是，CTAB的浓度不能太高，否则就会对酶蛋白的萃取效果造成不良影响。因为含水率在水相体积不变的情况下，会随着CTAB浓度的增大而减小，反胶团的大小也随之减小，当反胶团小于酶蛋白分子时，酶蛋白就不能进入到反胶团中[5]，因而当浓度超过0.025 mol/L时，吸光度会下降。根据以上分析最终选取CTAB的浓度为0.025 mol/L。

图2 CTAB浓度对提取效果的影响Fig.1 Effect of CTAB concentration on extraction

图3 正辛烷-正己醇对提取效果的影响Fig.3 Effect of n-octane-n-hexyl alcohol on extraction

3.2.2 正辛烷与正己醇的配比对提取效果的影响

正辛烷与正己醇的不同配比对小米蛋白酶提取效果的影响见图3，从图3中可以看出当正己醇的含量逐渐升高时吸光度也在逐渐升高，并且在比例为3.5∶1时达到最大(1.099)。但是，当比例小于3.5∶1，即正己醇含量更加高时吸光度值迅速减小。正己醇能够插入到CTAB分子之间，从而减弱CTAB分子之间的内聚力，增大了其在有机溶剂中的溶解度，促进了反胶束相的形成。但是，当正己醇含量太高时，反胶团表面上正己醇所占的比例过大，导致CTAB极性头之间的静电斥力减弱，反胶团的尺寸减小，形成空间位阻，以致无法包裹酶蛋白分子，使得萃取效果减弱[6]。综上结果选取正辛烷-正己醇混合液比例为3.5∶1。

3.2.3 氯化钾溶液浓度对提取效果的影响

不同浓度的KCl溶液对小米蛋白酶提取效果的影响见图4，从图4中可以看出当KCl浓度增至0.075 mol/L时吸光度值最大，为0.772。然后随着KCl溶液的浓度逐渐增大，吸光度值慢慢减小，并且在0.15 mol/L时达到最小。当钾离子浓度增大后，钾离子就会大量向“水池”移动并且取代酶蛋白，使得酶蛋白分子从“水池”盐析出来。钾离子浓度增大，反胶团内表面的双电层受到压缩而变薄，使得酶蛋白与反胶团内表面之间的静电吸引力减小，最终使萃取率降低。反胶团内表面的双电层变薄后，也减弱了CTAB之间的相互斥力，导致反胶团的内径变小，从而使酶蛋白分子不能进入反胶团中[7]。所以吸光度值会随着KCl浓度的增大而逐渐减小，综上所诉最后选取KCl溶液的浓度为0.075 mol/L。

3.2.4 小米蛋白酶溶液与反胶束相溶液的配比对提取效果的影响

小米蛋白酶溶液与反胶束相溶液的比例对小米蛋白酶提取效果的影响见图5，由图5可知，随着比例的增大吸光度值在逐渐的减小，而当比例为1∶1时达到最小(1.038)，但是当小米蛋白酶溶液与反胶束溶液的比例超过1∶1时，吸光度值就会随着比例的增大而逐渐增大。混合液中小米蛋白酶的含量会随着小米蛋白酶溶液与萃取液配比的逐渐减小而减小。当小米蛋白酶溶液与萃取液混合后的体积一定时，随着配比的逐渐减小，混合液中萃取液所占的比例渐渐增大。虽然混合液中小米蛋白酶的含量降低，但是反胶团的数量增多，所有反胶团中含有的小米蛋白酶总量也增大[8]。所以吸光度值也在增大。终合考虑选择小米蛋白酶溶液与萃取液的比例为1∶2。

图4 KCl浓度对提取效果的影响Fig.4 Effect of KCl concentration on extraction

图5 小米蛋白酶溶液与萃取液的配比对提取效果的影响Fig.5 Effect of the ratio of protease solution and active solution on the extraction of millet

3.3 正交实验结果与分析

正交实验结果见表3，根据回归方程计算出相应的酶含量并填入表3对应的空格内。然后使用“spss”电脑软件对实验结果进行方差分析，其中把极差最小的B项作为误差项，主体间效应检验结果见表4。根据表3的结果我们可以知道Rd﹥Rc﹥Ra﹥Rb，即四个因素对反胶束萃取的影响顺序为小米蛋白酶溶液与反胶束萃取液的比例﹥KCl浓度﹥CTAB浓度﹥正辛烷与正己醇的配比。根据表4中的方差分析结果可以发现因素A、C的Sig值都大于0.05，因素D的Sig值小于0.05，所以因素D对小米蛋白酶的提取效果有显著性影响，因素A、C对小米蛋白酶的提取效果均无显著性影响。综合上文的所有分析，确定小米蛋白酶的最佳提取条件为A2B1C2D3，即CT AB浓度为0.025 mol/L，正辛烷与正己醇比例为3∶1，KCl浓度为0.075 mol/L，小米蛋白酶溶液与反胶束溶液比例为1∶2。

3.4 验证实验结果与分析

根据正交实验的最佳结果进行验证实验，并在258 nm波长处测量吸光度值，分别得到三个水平的结果为0.824 g/L，0.825 g/L，0.824 g/L，均值为0.8243 g/L，接近正交实验的最佳结果，所以可以确定小米蛋白酶的最佳提取条件为CTAB浓度为0.025 mol/L，正辛烷与正己醇比例为3∶1，氯化钾浓度为0.075 mol/L，小米蛋白酶溶液与反胶束溶液比例为1∶2。

4 结论

本实验以优化小米蛋白酶的反胶束提取条件为目的，对四个不同的提取条件进行单因素实验，并将实验结果绘制成折线图，直观分析结果；然后以单因素实验结果为基础进行L9(34)正交实验，其中对四个单因素的三个水平分别设置为：CTAB浓度0.020 mol/L、0.025 mol/L、0.030 mol/L；正辛烷与正己醇比例3∶1、3.5∶1、4∶1；KCl浓度0.05 mol/L、0.075 mol/L、0.10 mol/L；小米蛋白酶溶液与反胶束溶液比例2∶1、1∶1、1∶2。最后对正交实验的结果进行直观分析和方差分析并得出最佳提取条件CTAB浓度为0.025 mol/L，正辛烷与正己醇比例为3∶1，氯化钾浓度为0.075 mol/L，小米蛋白酶溶液与反胶束溶液比例为1∶2。

表3 正交实验结果Table 3 Orthogonal experimental results

表4 正交实验结果方差分析Table 4 Analysis of variance of orthogonal experimental results