五味子乙素对肝癌细胞抑制作用的初步研究

黎鹏 李淑贤 邓子亮 郭洪胜 王森 何素辉(通讯作者)

(1 广东医科大学基础医学院组胚教研室 广东 东莞 523808)

(2 广东医科大学第二临床学院 广东 东莞 523808)

肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是我国高发病率的恶性肿瘤，严重危害人们生命健康。目前植物来源的药物已被广泛应用于肿瘤的预防与治疗，其中五味子乙素（schisandrin B，Sch B）就是一种备受关注的抑制肿瘤增殖的中药。研究发现，Sch B具有抗氧化、抗肿瘤、抗炎等多种药理作用[1-2]，可以抑制多种癌症如乳腺癌、肺癌和胆管癌等[3-5]肿瘤细胞的增殖和迁移。Sch B对HCC作用的报道比较少。因此，本课题组初步探讨了Sch B对HCC细胞体外增殖的影响，为进一步进行HCC的药物治疗提供实验基础和潜在的药物分子。

1.材料和方法

2.1 材料

人HepG2细胞和MHCC97H细胞为本实验室保存。胎牛血清、细胞培养基（DMEM）购买自Gbico公司。胰蛋白酶-EDTA消化液购自Life technologies公司；双抗(青霉素、链霉素)购自碧云天生物工程有限公司；五味子乙素和DMSO购自北京索莱宝科技有限公司；细胞增殖检测用CCK-8试剂盒由购自Dojindo。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养及分组 HepG2和MHCC97H细胞用DMEM培养基，置于37℃、含有5%CO2的恒温细胞培养箱中培养。给药前24h取对数生长期的HepG2和MHCC97H细胞，经0.25%胰酶消化后显微镜下进行细胞计数，按每孔3×105个细胞的数量，以每孔2mL细胞悬液铺于6孔板。实验分对照组和Sch B实验组（低剂量50μmol/L和高剂量100μmol/L）。

1.2.2 药物制备及给药 将1mLDMSO加入20mg Sch B粉剂中充分溶解，制成浓度为0.05mol/L的Sch B工作液。HepG2和MHCC97H细胞于6孔板培养24h后，对照组分别加入EMSO试剂2μL和4μL，五味子乙素实验组分别加入2μL（终浓度50μmol/L）和4μL（终浓度100μmol/L）的Sch B工作液。继续培养。

1.2.3 CCK-8实验 以每孔5×103细胞的数量，100μL细胞悬液铺板于96孔板中，每组细胞5个复孔，给药后24h、48h、72h时分别加入CCK8每孔10μL，1～2h后酶标仪检测450nm吸光度值并计算细胞增殖抑制率。

1.3 统计学分析

数据采用SPSS20.0统计软件进行统计学分析，计数资料采用率（%）表示，进行χ2检验，计量资料采用（±s）表示，进行t检验，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2.结果

2.1 Sch B处理的肝癌HepG2和MHCC97H细胞增殖能力下降

CCK8试验结果显示，加药处理24h、48h、72h后，Sch B组肝癌细胞的增殖与对照组相比，HepG两组在Sch B 50μmol/L剂量，于24h、48h、72h分别抑制了约19.62%，19.05%，11.33%，24h～72h差别均有统计学意义(P＜0.05)；在Sch B 100μmol/L剂量，于24h、48h、72h分别抑制了约4.35%，11.67%，16.03%，d2～72h差别均有统计学意义(P＜0.05)。MHCC97H组在Sch B 50μmol/L剂量，24h、48h、72h分别抑制了约4.43%，9.66%，26.84%，仅有72h差别有统计学意义(P＜0.05)；在Sch B 100μmol/L剂量，于24h、48h、72h分别抑制了约24.38%，33.56%，52.36%，24h～72h差别均有统计学意义(P＜0.05)，见图1A、B。本结果提示Sch B可抑制肝癌HepG2和MHCC97H细胞体外增殖能力。

另外，对比同样浓度Sch B对两种细胞增殖影响的差异，在50μmol/L给药处理的结果中，Sch B对两种肝癌细胞株的增殖影响的差异在24h和72h有统计学意义（P＜0.05），48h则无差别；而在100μmol/L浓度，Sch B对两种肝癌细胞株的增殖影响的差异在24h～72h均有统计学意义（P＜0.05）。见图1C、D。

2.2 Sch B对肝癌HepG2和MHCC97H细胞形态的影响

SCH B组HepG2细胞和MHCC97H在加药处理培养24h、48h和72h后，和对照组相比较，细胞数量均有所减少，细胞变小，死亡细胞增多。以HepG2细胞在50μmol/L的 SCH B加药处理，以及MHCC97H细胞100μmol/L的 SCH B加药处理后，细胞增殖抑制尤为明显，如图E-P所示。

图 Sch B加药处理的HepG2和MHCC97H细胞增殖（%）和细胞形态(×200)

3.讨论

五味子乙素（schisandrin，Sch B）是从中药五味子中提取出来的活性物质，分子量是400.46，属木脂素类，是五味子的主要活性成分之一[6]，近年来研究发现它具有抗肿瘤作用，诱导肿瘤细胞分化及凋亡、逆转肿瘤细胞多耐药性、增加其他抗肿瘤药物的敏感性、抑制肿瘤血管生成等机制来抑制肿瘤的生长及转移[7-8]。研究发现Sch B能够促进阿霉素在人肝癌细胞系(SMMC7721细胞)诱导的凋亡[7]。本研究为Sch B对HCC细胞抗肿瘤作用的补充，进一步在两株人肝细胞癌HepG2细胞和MHCC97H细胞中探讨其对增殖的影响。

本实验CCK-8结果发现，Sch B组肝癌细胞的增殖与对照组相比，两种剂量的HepG2细胞组和HCC97H细胞组都有增殖抑制。另外，对比同样浓度Sch B对两种细胞增殖影响的差异，并且在50μmol/L Sch B作用下，肝癌HepG2细胞受到增殖抑制比MHCC97H细胞的早；而在100μmol/L浓度，Sch B对两种肝癌细胞株的增殖影响的差异均有统计学意义，说明Sch B作用于肝癌MHCC97H细胞发挥的增殖抑制比HepG2细胞的出现得早及明显。镜下观察肝癌细胞形态和数量，发现Sch B组细胞在加药处理后，细胞数量均有所减少，细胞变小，死亡细胞增多，从形态学上进一步证实Sch B确实可以抑制肝癌细胞的体外增殖能力，尤其是对MHCC97H细胞。综上，本研究发现，Sch B能有效地抑制HepG2细胞和MHCC97H细胞的细胞增殖能力，为将来进一步深入研究分子机制打下基础，也为肝癌防治提供潜在的新型药物分子。