下调脂肪酸合成酶表达对膀胱癌UMUC3细胞增殖、迁移及侵袭能力的影响*

颜新建，李高峰△，唐 梅，杨小平

(1. 中南大学湘雅医学院附属株洲医院肿瘤科，湖南 株洲 412000；2. 湖南师范大学医学院 小分子靶向药物研究与创制湖南省重点实验室，湖南 长沙 410013)

膀胱癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤，在男性恶性肿瘤中发病率高居第4，早期膀胱癌预后一般较好，但发展到中晚期整体预后较差，治疗成本高，防治形势不容乐观[1]。因此深入探讨膀胱癌的发病机理及寻求新的治疗方法尤为重要。脂肪酸合成酶(fatty acid synthase, FASN)是催化乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A合成棕榈酸酯的关键酶，为机体储存能量，参与细胞脂质代谢。FASN在正常人体组织中除脂肪组织、肝组织、新生儿肺脏外表达很低，而研究报道多种肿瘤如乳腺癌、结肠癌、乳腺癌、前列腺癌等存在FASN高表达，可见FASN与肿瘤发生、发展密切相关，FASN可能是潜在的肿瘤治疗靶点[2-5]。目前其在膀胱癌中的报道少见，因此本实验组就FASN在膀胱癌及正常膀胱组织中的表达，利用siRNA技术抑制FASN表达后对膀胱癌细胞增殖、迁移、侵袭能力的影响进行了研究。

1 材料与方法

1.1 材料与分组

从中南大学湘雅医学院附属株洲医院病理科收集45例石蜡块，包括30例膀胱癌电切术后获得的膀胱癌组织及15例膀胱造瘘术后活检获得的正常膀胱组织，用作对照，蜡块连续切片用于后续免疫组化，组织病理结果经我院2位病理科医生证实；以上组织均得到被取材人口头同意，并征得医院伦理委员会批准及经患者同意；人膀胱癌细胞系UMUC3由郭鹏教授馈赠；反转录聚合酶链反应(RT-PCR)试剂盒、羊抗兔二抗购自天根生化科技公司；脂质体2000购自美国QIAGEN公司；FASN siRNA及无义siRNA由擎科生物科技有限公司合成；兔抗人FASN抗体为美国CST公司产品。胰蛋白酶、DMEM培养基、新生牛血清、牛血清蛋白购自美国Gibco公司，标准蛋白mark为Thermo公司产品。

1.2 免疫组织化学法检测膀胱癌组织中FASN蛋白表达

采用免疫组化PV-6000法依次对组织切片行脱蜡、水化，枸橼酸盐修复液修复抗原、血清封闭，一组滴加FASN抗体(1∶1 000)，另一组滴加PBS作为对照，4℃孵育过夜，PBS清洗3次，加二抗(辣根过氧化物酶标记二抗)室温孵育1 h,DAB液显色，苏木素行核复染，水洗并观察染色程度，分化、脱水、封片后显微镜下观察。FASN蛋白表达阳性表现为细胞质呈棕黄色分布，根据阳性细胞所占比例来确定FASN蛋白表达强弱：(1)无阳性细胞(-)；<25%细胞呈阳性(+)；>25%细胞呈阳性(++)；>50%细胞为强阳性(+++)。

1.3 UMUC3细胞培养及转染

人膀胱癌UMUC3细胞株用含10%胎牛血清的DMEM培养基置于37℃、5%CO2恒温箱中培养，取生长状态好的细胞用于后续实验。将200 μl细胞悬液包含8×104cells接种于96孔板，当细胞融合达到90%时进行转染，利用脂质体2000将FASN siRNA及无义siRNA转染细胞，依据转染siRNA不同分siFASN组(转染FASN siRNA)及siControl组(转染无义siRNA)，继续培养，免疫荧光法鉴定转染效果。

1.4 MTT法检测UMUC3细胞的增殖活力

收集对数生长期细胞，混匀接种于96孔板，使用完全培养基培养24 h后，换DMEM培养基继续培养12 h，待细胞长至对数生长期时转染FASN siRNA和无义siRNA，转染后继续培养。48 h后除去培养基，PBS洗2遍，加入50 μl MTT溶液，继续培养5 h，随后吸去培养基加150 μl二甲基亚砜，避光振荡10 min,每组细胞实验重复3次，于酶标仪490 nm波长处检出每孔OD值,计算细胞增殖抑制率。

1.5 细胞划痕实验检测UMUC3细胞的迁移能力

接种5×105cells于6孔板，按照脂质体2000转染说明书方法进行转染，转染24 h后观察细胞生长情况，待细胞贴壁后，用10 μl枪头划痕，划线过程中使枪头保持垂直，PBS清洗1遍，继续培养，分别于划后0 h、24 h、48 h拍照，每组细胞实验重复3次。划痕迁移能力=(0 h划痕宽度-24 h划痕宽度)/0 h划痕宽度×100。

1.6 Transwell实验检测UMUC3细胞的侵袭能力

收集胰酶消化悬浮的细胞，无血清培养基重悬为单细胞悬液，细胞计数，调整细胞密度为1.5×105cells/ml。使用10 μm孔径的Transwell小室进行细胞侵袭力检测，将200 μl细胞悬液包含3×104个细胞加入24孔板Transwell小室中。在24孔板下室加入600 μl完全培养基，继续培养。24 h后用湿棉签擦去小室内的细胞，小室底膜用结晶紫染色，PBS清洗小室，彻底晾干后显微镜下拍照。每片随机选取5个100×视野计数，取平均数进行分析。

1.7 实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测UMUC3细胞FASN mRNA表达

根据Trizol说明书提取细胞总RNA。反转录试剂盒将mRNA反转录为cDNA,FASN引物序列(由擎科生物科技有限公司合成)为：上游引物：5＇-TGCCCTGAGCTGGACTACTT-3＇，下游引物：5＇-AAAGCTGCTCAGGACCATGT-3＇；RT-PCR反应条件：95℃ 150 s，95℃ 30 s、55℃ 20 s、72℃ 30 s共循环35次。以GAPDH为内参，采用2-ΔΔCT法计算FASN mRNA相对表达水平。

1.8 蛋白印迹法(Western blot)检测UMUC3细胞FASN蛋白表达

按试剂盒说明书操作提取总蛋白，BCA法测定细胞蛋白浓度。每样本100 μg进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，转膜，5%脱脂奶粉TBST液封闭1 h，一抗杂交(FASN,1∶1 000；β-actin,1∶ 5 000)，4℃孵育过夜，清洗，二抗(羊抗兔1∶ 5 000；羊抗鼠 1∶5 000)37℃孵育1 h,暗室中显影，Image J软件分析蛋白相对表达量。

1.9 统计学处理

2 结果

2.1 FASN蛋白在膀胱癌组织中的表达情况

免疫组化结果显示FASN蛋白在膀胱癌组织中过表达，表现在细胞质中呈棕黄色分布(图1，见彩图页Ⅲ)，30例膀胱癌组织中有18例FASN蛋白表达阳性，而15例正常膀胱组织中均无FASN蛋白阳性表达，膀胱癌组织中FASN蛋白阳性率(60.0%)显著高于正常膀胱组织(0.0%，P=0.000),且膀胱癌组织中FASN蛋白表达与病理分期及分级密切相关，FASN蛋白阳性表达率随病理分期、分级的增高而增加，差异具有统计学意义(P<0.05, 表1)。

Tab. 1 Expression levels of FASN protein in bladder cancer and normal bladder tissues (n=45)

GroupnFASN(+)FASN(-)χ2PNormal bladder tissue1501515.0000.000∗∗Bladder carcinoma tissue301812 Pathological stageTa-T1T2-T42371171206.0870.014# Pathological gradeG1G2G3141245949307.2320.027△

**P<0.01vsnormal bladder tissue group;#P<0.05vsTa-T1 group;△P<0.05vsG1 group

2.2 FASN转染效果鉴定及对 FASN表达影响

筛选、鉴定转染成功的细胞株，观察 siFASN组和siControl组细胞，发现绿色荧光蛋白在两组细胞胞质中均有不同程度的表达，同等大小视野下siFASN组荧光蛋白表达量明显少于siControl组(P<0.05，图2，见彩图页Ⅲ)；RT-PCR结果示siFASN组、siControl组FASN mRNA相对表达量分别为1.17±0.11，0.42±0.13；siFASN组细胞FASN mRNA水平明显低于siControl组，差异具有统计学意义(P< 0.05，表2)，Western blot结果示siFASN组、siControl组FASN蛋白相对表达量分别为：0.96±0.11，0.18±0.08，siFASN组细胞几乎无FASN蛋白表达(图3)，转染效果好，与siControl组比较差异具有统计学意义(P<0.05)。

Fig. 3 FASN expression changes after transfection of FASN siRNA in UMUC3 cells (n=3)

2.3 下调FASN表达对UMUC3细胞增殖的影响

MTT检测结果显示siFASN组细胞在48 h、72 h时的增殖抑制率分别为：38.12%±1.44%、58.33%±3.52%，siControl组细胞在48 h、72 h时的增殖抑制率分别为：21.97%±1.39%、30.83%±1.92%，差异具有统计学意义(P<0.05，表2)；膀胱癌细胞转染FASN siRNA后生长抑制明显，且具有时间依赖性。

2.4 下调FASN表达对UMUC3细胞迁移能力的影响

划痕实验结果显示在24 h、48 h siFASN组细胞迁移距离较siControl组短(图4)，siFASN组、siControl组细胞平均迁移能力分别为：20.44±1.47、 79.04±2.11，siFASN组细胞的迁移能力较siControl组明显下降，差异具有统计学意义(P<0.05，表2)。

Tab. 2 The FASN mRNA, proliferation and migration ability changes after transfecting FASN siRNA into UMUC3 cell lines n=3)

*P<0.05vsthe siControl group

2.5 下调FASN表达对UMUC3细胞侵袭能力的影响

Transwell试验结果显示siFASN组、siControl组平均过膜细胞数分别为66.70±2.01、175.10±2.14,siFASN组平均过膜细胞数较siControl组明显减少，即siFASN组细胞的侵袭能力较siControl组明显下降，差异具有统计学意义(P<0.05，图5)。

Fig. 4 Cell migration ability changes after transfection of FASN siRNA in UMUC3bladder cancer cells (Inverted microscope × 40)

*Pvsthe siControl group

3 讨论

膀胱癌是我国男性发病率第6位的流行性恶性肿瘤[6]，早期阶段预后一般较好，但发展到中晚期常规治疗疗效欠佳，靶向治疗有望成为新的突破口。目前已有研究发现肿瘤细胞的生物代谢方式与正常细胞不同，特别是糖代谢和脂质代谢，研究证实肿瘤细胞自身合成的脂肪酸占其所有脂肪酸的90%以上，肿瘤细胞可通过WarBurg效应在产能的同时生成大量的乙酰辅酶A(CoA)[7]，乙酰辅酶A及丙二酰辅酶A是脂肪酸合成酶(fatty acid synthase FASN)的底物，FASN催化乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A合成长链脂肪酸，这些长链脂肪酸随后转化为对于肿瘤细胞生物膜及脂质合成、蛋白修饰定位、信号转导等至关重要的代谢脂质，为肿瘤细胞增殖、侵袭转移提供优越条件，发挥其恶性生物学行为[8,9]，FASN对于肿瘤细胞异常代谢尤其是脂质代谢至关重要，研究FASN对肿瘤的发病机制及干预其生物学行为等具有十分重大的意义。

目前，FASN被报道在多个瘤种如胰腺癌、结直肠癌、乳腺癌、前列腺癌中过表达，FASN在肿瘤组织中过表达而在绝大多数正常组织中低表达或无表达的特性使其有望成为新的肿瘤治疗靶点。LIANG SUN等[10]用Western blot法发现胃癌组织中FASN蛋白高表达，随后用siRNA技术发现沉默FASN可通过mTOR/GLIL信号通路抑制胃癌细胞的增殖、转移。JIAOJIAO GONG等[11]也有类似的发现，体外实验表明抑制FASN可以有效干扰肿瘤细胞的增殖、浸润转移等。本研究采用免疫组化法发现FASN在膀胱癌组织中过表达，且与病理分期及分级密切相关，FASN阳性表达率随着病理分期和分级的增高而升高，差异具有统计学意义(P<0.05)，与邓雷弘等[12]研究结果一致，这提示FASN表达可能是膀胱癌发生、发展中一个重要的分子事件，FASN阳性表达率与膀胱癌的浸润深度、转移密切相关，FASN对鉴别膀胱癌恶性分型及分期可能有一定的作用，由于本研究组织数量偏少，这一结果还需大样本研究佐证。

进一步研究下调FASN表达对UMUC3膀胱癌细胞生物学特性的影响，相比siControl组,我们发现siFASN组细胞FASN表达在蛋白质水平和mRNA水平均明显下降，siFASN组细胞的增殖、迁移、侵袭能力均明显下降(P<0.05)，抑制FASN表达使膀胱癌UMUC3细胞各项生物学功能均下调，与LIANG SUN、JIAOJIAO GONG等的研究结果一致，由于其较高的靶向性，这一结果提示抑制FASN表达可能高效的抑制癌细胞的生长，而无明显的副作用。已有研究表明抑制FASN表达可使肿瘤细胞出现脂质代谢紊乱，自身合成脂肪酸的能力下降，肿瘤细胞因脂肪酸供应不足而出现脂质饥饿，使其失去生长优势条件，影响其各项生物学功能，最终表现为肿瘤细胞生长、侵袭及转移能力的广泛抑制。FASN介导的肿瘤细胞特殊的脂质代谢方式受多条信号通路调控，研究最多的是PI3K/AKT通路[13, 14]，PI3K/AKT信号通路与细胞增殖、分化、代谢密切相关，细胞表型恶化与PI3K/AKT信号通路异常激活相关，FASN基因被认为是PI3K/AKT信号通路的一个下游基因。LIGONG CHANG等[13]研究发现下调FASN表达可抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路活性，上游基因异常激活如肿瘤相关致病因素使FASN过表达，从而改变细胞脂质代谢方式利于细胞恶变，并为其增殖、侵袭、转移行为等提供优势条件。抑制FASN可能通过抑制PI3K/AKT等相关通路活性影响细胞代谢和生物学行为从而发挥抗肿瘤效应。目前FASN抑制剂已广泛用于抗肿瘤研究，频繁报道出新型FASN抑制剂，如生物槟郎碱可显著降低脂肪细胞内FASN蛋白的表达[15]，影响其脂质代谢；部分药物如TVB-2640在抗肿瘤中的有效性及安全性在I期临床试验中已有初步探讨[16]，目前来看FASN抑制剂具有良好的应用前景和发展空间,期待有大样本的临床研究。

总之，本研究首先在组织学水平上发现FASN在膀胱癌组织中过表达而在正常膀胱组织中无表达，进一步探究发现下调FASN表达能抑制膀胱癌UMUC3细胞的增殖、迁移、侵袭能力，FASN在膀胱癌中具有较高的靶向性，使FASN抑制剂有可能在高效杀伤肿瘤细胞的同时不产生严重的毒副作用，本文的研究结果可为FASN抑制剂的后续研究提供理论基础，FASN可能是膀胱癌潜在的治疗靶点，抑制FASN表达有望成为一种新的膀胱癌治疗方法。