在食管癌细胞增殖过程中蛋白酶激活受体-2(PAR-2)对细胞周期蛋白D1(CyclinD1)的调控机制*

张其良, 曹文理, 邓全军

(1. 天津市第四中心医院消化内科，天津 300140；2. 天津市北辰医院呼吸内科，天津 300400；3. 武警特色医学中心，天津 300162)

在我国，食管癌是一种较常见的消化道恶性肿瘤，预后差，并且近几年食管癌的发病率和死亡率呈逐年升高的趋势[1,2]。食管癌细胞的增殖、转移以及侵袭力是影响患者疗效以及预后的的一个重要因素，其发生、发展机制目前仍不太明确。蛋白酶激活受体-2(proteinase-actived receptors 2，PAR-2)属于细胞膜表面受体，广泛分布于体内多种组织和器官中，胰蛋白酶、类胰蛋白酶、凝血因子等是该受体的天然激动剂，SLIGKV为其人工合成的有效的激动剂。PRA-2激活后参与介导炎症反应、影响肿瘤细胞的存活、生长、侵袭转移以及瘤体新生血管的形成；细胞外调节蛋白激酶1(extracellular regulated protein kinase1, ERK1)通路是丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)通路中的一个重要通路而MAPK是PAR-2下游的一个重要信号通路，因此我们可得出推论：ERK1信号通路在人类恶性肿瘤细胞的生长和预后中扮演重要角色；CyclinD1蛋白在细胞周期中起到正向调控作用，如果相关基因被激活后导致CyclinD1蛋白持续高表达，这将会使细胞周期的G1期显著缩短，提前进入S期，从而导致细胞增殖失控，形成肿瘤[3-5]。本课题组前期已成功构建了稳定的PAR-2 shRNA食管癌EC109细胞系，运用MTT、流式细胞和Transwell小室方法检测发现：激活PAR-2后，食管癌细胞EC109的增殖力和侵袭迁移力增强；靶向沉默PAR-2后，食管癌细胞EC109的增殖力和侵袭迁移力均受到负向影响[6-8]。本实验此次进一步探讨在食管癌细胞EC109的增殖过程中PAR-2是否可通过调节其下游MAPK通路(ERK1)进而调节CyclinD1的表达从而促进食管癌细胞的增殖。

1 材料与方法

1.1 材料

PAR-2基因表达下调的人食管癌稳定细胞株 PAR-2 shRNA EC109(前期稳定转染获得)；RPMI1640 培养基购GIBCO公司；FBS(胎牛血清)购自PAN公司；细胞总RNA提取试剂盒购自天根公司；逆转录试剂盒购自天根公司；RT-PCR试剂盒购自天根公司；β-actin抗体购自北京中杉公司；PAR-2、ERK1/2、p-ERK1/2、 CyclinD1一抗及二抗购自武汉博士德公司；PAR-2激动剂SLIGKV、反激动剂VKGILS及PD98059购自APEXPIO公司；β-actin、PAR-2、ERK1、CyclinD1基因PCR引物由北京鼎国昌盛生物技术公司合成。

1.2 细胞培养及分组

选用含10%FBS(PAR-2 shRNA EC109细胞另含0．2 μg/ml的G418)的1640培养基，置于孵育箱中培养(孵育条件：37℃，5%CO2)，细胞贴壁生长，显微镜下观察细胞生长，当细胞铺满培养瓶底部70%～80%时进行传代取对数生长期细胞用于实验。分组设计：(1)空白对照组：未经任何处置的EC109细胞；(2)PAR-2激动组：加入50 nmol/LPAR-2激动剂(SLIGKV)的EC109细胞；(3)PAR-2反激动组：加入50 nmol/LPAR-2反激动剂(VKGILS)的EC109细胞；(4)PAR-2 shRNA组：PAR-2shRNA成功转染EC109细胞并稳定表达；(5)MAPK抑制组：加入50 μmol/L MAPK阻滞剂( PD98059)预处理1 h后，加入50 nmol/L SLIGKV；以6×104cells/ml的密度接种于培养瓶中，置于孵育箱中培养24 h后使用PBS清洗3次，更换为无血清的1640培养基培养24 h，之后各实验组按实验设计分别加入所需试剂，每组设置3个复孔，于孵育箱中继续培养24 h，检测PAR-2、ERK1、CyclinD1的mRNA的表达水平和PAR-2、ERK1、p-ERK1、CyclinD1的蛋白表达水平。

1.3 RT-PCR方法检测基因表达

各组细胞祛除废弃培养基后使用PBS清洗3次，加入350 μl的裂解液RL，反复吹打使细胞完全裂解，取细胞悬液移至RNase-Free 离心管中混匀。将混匀后的细胞悬液加入过滤柱，移至RNase-Free 离心管，12 000 r/min离心2 min，然后将1倍体积的乙醇混入滤液中后再次加入吸附柱，同上高速离心2 min，弃掉上层废液后加入350 μl去蛋白液，高速离心2 min，弃废液；加入80 μl DNase l工作液，室温静置15 min再次加入去蛋白液，同上；加入500 μl漂洗液，室温静置2 min，同上高速离心2 min，弃废液(此步骤重复2次)；将吸附柱放入新的RNase-Free 离心管中，加入40 μl的RNase-Free ddH2O，同上高速离心2 min，得到RNA溶液。对RNA溶液进行吸光度检测，采用OD260/OD280的比值在1.8～2.0之间的RNA溶液进行实验。按产品说明书配制混合液；设置扩增条件：95℃预变性15 min，95℃变性10 s，60℃退火/延伸32 s；40个循环60℃检测荧光信号。上述设置完成后，把加入反应液的96孔板置入PikoReal Real-time PCR仪进行检测。采用相对定量检测目的基因和内参基因，以 2-△△Ct来表示各基因的表达量(△Ct=Ct目的基因-Ct内参基因，△△Ct=△Ct处理组-△Ct对照组)。

1.4 Western blot检测蛋白表达

(1)蛋白提取：各组细胞去掉废弃培养液，使用提前预冷的PBS(4℃)对细胞贴壁细胞进行清洗(2遍)。于冰上进行操作，每瓶细胞加400l含PMSF(100 mmol/L)的裂解液(RIPA完全裂解液)裂解60 min；高速离心，上清液即为蛋白提取液。按BCA试剂盒说明配制0.5 mg/ml的蛋白标准液，绘制标准曲线，计算出样本蛋白浓度。(2)SDS-PAGE电泳：根据测得的总蛋白浓度，每例标本取总蛋白30 μg，5 % SDS-PAGE 80 V电泳30 min；12% SDS-PAGE 120 V电泳90 min，然后采用半干法转印于PVDF膜上。(3)封闭：用5%的脱脂奶粉室温振摇封闭1 h。(4)孵一抗：用抗体稀释液(2%脱脂奶粉) 1∶200稀释一抗，4℃冰箱孵育16 h；1×TBST 液洗膜3次,每次10 min。(5)孵二抗：同样方法, 1∶2 000 稀释二抗，室温孵育1 h，1 ×TBST 液洗膜3次，每次10 min，然后放入1 ×TBS中。(6)显影：加ECL显影液，显影。

1.5 统计学处理

2 结果

2.1 RT-PCR方法检测基因表达结果

与空白对照组相比较：PAR-2激动组PAR-2 mRNA的表达量是其2.651倍(P<0.05)，PAR-2 shRNA组PAR-2 mRNA的表达量是其0.385倍(P<0.05)，MAPK抑制组中PAR-2 mRNA的表达量与其无明显差异(P>0.05)；PAR-2激动组ERK1 mRNA的表达量是其2.580倍(P<0.05),PAR-2 shRNA组ERK1 mRNA的表达量是其0.376倍(P<0.05)，MAPK抑制组 ERK1 mRNA的表达量是其0.497倍(P< 0.05)；与空白对照组相比较，PAR-2激动组CyclinD1 mRNA的表达量是其2.012倍(P<0.05),PAR-2 shRNA组CyclinD1 mRNA的表达量是其0.318倍(P<0.05)，MAPK抑制组 CyclinD1 mRNA的表达量是其0.422倍(P<0.05)；与空白对照组相比较，PAR-2反激动组的PAR-2 mRNA、ERK1 mRNA及CyclinD1 mRNA的表达均未见明显改变(P>0.05，图1)。

Fig. 1 The expression levels of PAR-2,ERK1 and CyclinD1 mRNA in each group

1: Blank group; 2: Excited group; 3: Anti excited group; 4: Transfected group; 5: MAPK Inhibition group

2.2 Western blot检测蛋白表达结果

与空白对照组相比较，PAR-2激动组PAR-2蛋白、p-ERK1蛋白以及CyclinD1蛋白的表达量均升高(P<0.05)；与空白对照组相比较，PAR-2 shRNA组PAR-2蛋白、p-ERK1蛋白以及CyclinD1蛋白的表达量均降低(P<0.05)；与空白对照组相比较，MAPK抑制组p-ERK1蛋白、CyclinD1蛋白的表达量均降低(P<0.05)；与空白对照组相比较，PAR-2反激动组PAR-2、p-ERK1、CyclinD1蛋白的表达量未见明显差异(P<0.05)；ERK1在各组中表达无明显差异(P>0.05，图2)。

Fig. 2 The expression levels of PAR-2,ERK1, p-ERK1 and CyclinD1 proteins in each group

1: Blank group; 2: Excited group; 3: Anti excited group; 4: Transfected group; 5: MAPK Inhibition group

3 讨论

PARs存在于细胞膜表面，其为G蛋白偶联受体，属于七次跨膜单位的受体家族(GPCRs)中的一员，其中PAR-2为胰蛋白酶细胞表面受体，被胰蛋白酶激活参与介导炎症反应，影响肿瘤细胞的存活、生长、侵袭转移以及瘤体新生血管的形成[3]。编码PAR-2的基因位于染色体5ql3，包括2个外显子和1个内含子[9]。PAR-2可被人体内多种内源性物质如胰蛋白酶、凝血因子TF/Ⅶa复合物、Xa、类胰蛋白酶、纤溶酶等激活[10]。

丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)是PARs下游的一个重要信号通路，其中ERK1/2更是主要通路中的主要通路，其主导的细胞促有丝分裂和抗凋亡信号在人类恶性肿瘤细胞的生长和预后中扮演重要角色。在肝癌细胞中，PAR-2通过影响ERK1/AP-1途径、Ca2+信号途径，从而影响肿瘤细胞的增殖、侵袭、转移[11-13]。本实验组前期研究发现PAR-2活化可通过增加MMP-2表达促进人胰腺癌细胞的侵袭和迁移[14]，同时Ungefroren H等研究在发现胰腺癌中PAR-2高表达后可以增强转化生长因子-β(transforming growth factor-β, TGF-β)的表达，从而诱导其发生转移和侵袭[15]。本实验运用RT-PCR的方法检测PAR-2激动后，ERK1 mRNA的表达较空白对照组表达增高，而PAR-2 shRNA组和MAPK通路抑制组ERK1 mRNA的表达较空白对照组表达减少；运用Western blot的方法检测PAR-2激动后，ERK1蛋白的表达在各组中未见明显改变，而p-ERK1蛋白在PAR-2激动组的表达量高于空白对照组，p-ERK1蛋白在 PAR-2 shRNA组和MAPK抑制组表达低于较空白对照组。我们可以推测，在食管癌细胞EC109中，PAR-2激动后可以增加ERK1基因的表达，但是ERK1蛋白并没有增加，而p-ERK1蛋白表达在PAR-2激动后表达增加。

细胞由前一次有丝分裂进入的下一次有丝分裂完成所经历的连续动态增殖过程称为正常细胞周期，包括G1、S、G2和M期。CyclinD1蛋白在细胞周期中起到正向调控作用，在正常生理状态下细胞进人S期后CyclinD1蛋白会迅速分解，保证细胞周期的正常进行。CyclinD1蛋白与cdk4、cdk6结合，使Rb蛋白磷酸化，进而调控转录激活因子E2F等游离出来并进入细胞核内，使细胞进入S期，合成DNA，从而使细胞进入增殖状态；如果相关基因被激活后导致CyclinD1蛋白持续高表达，这将会显著缩短G1期，致使细胞周期提前进入S期，使细胞增殖失控，形成肿瘤[4,5,16-18]。本实验研究结果显示：在PAR-2激动组中，CyclinD1 mRNA和CyclinD1蛋白的表达相比较于空白组均增高，而在PAR-2 shRNA组和MAPK抑制组，CyclinD1 mRNA和CyclinD1蛋白的表达相比较于空白组均减少，提示在食管癌细胞EC109中，激活PAR-2后可以通过MAPK ERK1通路上调CyclinD1在基因和蛋白层次的表达，从而加速食管癌细胞细胞EC109的增殖。

综上所述，我们的研究表明：(1)在食管癌细胞EC109中，PAR-2激动后，可以使其下游通路中ERK1基因及p-ERK1蛋白的表达增加，从而加速食管癌细胞EC109的细胞周期进程，促使其增殖加速；反之，PAR-2抑制后，可以使其下游通路中ERK1基因及p-ERK1蛋白的表达降低，从而减缓食管癌细胞EC109的细胞周期进程，促使其增殖变慢。(2)PAR-2激动后，可以通过上调其下游通路中MAPK ERK1从而上调CyclinD1 mRNA和CyclinD1蛋白的表达，加快细胞周期，促进食管癌细胞EC109的增殖；反之，PAR-2抑制后可以通过下调其下游通路中MAPK ERK1从而下调CyclinD1 mRNA和CyclinD1蛋白的表达从而减缓食管癌细胞EC109的细胞周期进程，促使其增殖变慢。(3)在食管癌细胞EC109细胞中MAPK ERK1为PAR-2调节CyclinD1的中间通路，PAR-2激活或抑制后，MAPK ERK1的表达随之改变，从而影响CyclinD1表达量，进而调节细胞周期，参与食管癌细胞EC109细胞增殖的调控。但CyclinD1在食管癌细胞EC109中是否也被其他通路调节、又有哪些通路参与CyclinD1的调节，以及通路中ERK1蛋白、p-ERK1蛋白表达存在差异这些问题目前仍不太明确，下一步我们将继续深入研究。