芹菜多糖抑制小鼠肺癌的作用研究*

蒋盼若, 楼恩哲，赵智祥，徐炯楠，郑晓菲，柯瑞君，陈佳玉

(绍兴文理学院医学院，浙江 绍兴 312000)

肺癌是世界范围内的一大健康问题。据统计，2014年肺癌占所有恶性肿瘤发病率、死亡率首位，在男性恶性肿瘤中分别占比24.63%和29.49%。手术、放疗和化疗是肺癌治疗的常用策略。然而，肺癌患者总是在晚期才被确诊，肺癌的5年生存率为16%，其中小细胞肺癌的5年生存率仅为6%。因此，寻找一种能有效治疗肺癌的药物是非常必要和迫切的。

近年来，人们越来越认识到草本植物和植物来源的药物具有很强的抗肿瘤潜力[1,2]，如紫杉醇、伊立替康和依托泊苷均提取自美国食品和药物管理局批准用于肿瘤治疗的植物药[3]。芹菜是食药两用植物中的一种，已被证明具有许多生物学和药理学功能，如抗炎、抗氧化和抗微生物等[4]。目前已从芹菜中提取多种成分，其中芹菜素、木犀草素、金圣草黄素、香豆素以及多种聚乙炔和酞类化合物已被证明具有肿瘤抑制作用[5]。芹菜素是芹菜的主要成分，能够抑制乳腺癌、皮肤癌、前列腺癌、消化道肿瘤和某些血液恶性肿瘤的生长[6]。芹菜中的聚乙炔对急性淋巴细胞白血病有抗增殖活性和抑制生长的作用[7]。芹菜薄壁细胞的初生壁主要由果胶多糖组成[8]，该芹菜多糖(polysaccharides from celery, PSC)在芹菜中占有很大的比重，但芹菜多糖对肿瘤，尤其是肺癌的作用及相关机制一直未引起关注。本研究探讨了芹菜多糖是否为芹菜的生物活性成分，可否参与抑制肺癌细胞生长，并探索其潜在的分子机制，以期为肺癌治疗新药的发现提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

4～5周龄C57BL/6 小鼠购于浙江省实验动物中心；各PCR引物的合成由上海Sangon Biotech公司完成；AnnexinV-FITC/PI双染试剂盒为美国BD公司产品；TRIzol和SuperScript® III First-Strand Synthesis System来自美国Invitrogen公司；TOSOH BIOS TSK - Gel G4000 SWXL柱(7.8×300 mm)源自日本TOSOH BIOS公司；Waters Alliance 2410 RI检测器为美国Waters公司产品；标准葡聚糖于美国Sigma公司采购。

1.2 多糖的制备

粗多糖的分离和纯化遵循先前文献中描述的方法[9]。简而言之，从超市购买新鲜芹菜，在80℃下用乙醇提取三次，提取时间为3 h，残渣在100℃下用水煎煮三次，提取时间为3 h(固液比，1∶40 g /ml)，3 000×g条件下离心10 min后，水提取物在60℃真空浓缩，用三倍体积乙醇处理，4℃冰箱中沉淀过夜。将沉淀物重新悬浮在水中，并用蒸馏水透析(渗透极限分子量为3.5 kD)，不可透析部分在-20℃冷冻，解冻后再次离心以除去不溶性物质。重复冻融10次后，将上清液冻干，收获粗多糖部分。将粗多糖(6%)溶于蒸馏水中，并将其装载到DEAE - Sephadex A - 25柱( 90 cm×5 cm )上。用蒸馏水、0.3 mmol/L和0.5 mmol/L NaCl连续洗脱该柱，每次直至苯酚-硫酸法洗脱碳水化合物阳性反应消失。收集 0.5 mmol/L NaCl洗脱部分，透析并冻干。将含有碳水化合物的馏分合并、透析、冻干，并进一步应用于Sephadex G - 100柱(100 cm×3.5 cm)上，以获得纯化的多糖；浓缩目标馏分，再次透析并冻干。

用配有TOSOH BIOS TSK - Gel G4000 SWXL柱的Waters 515凝胶渗透色谱法测定芹菜多糖的分子量。该柱用0.1 mmol/L硝酸洗脱，并用标准葡聚糖校准，洗脱由Waters Alliance 2410 RI检测器监控。以D -葡萄糖为标准，用苯酚-硫酸法定量碳水化合物；以牛血清白蛋白为标准，用Bradford法测定蛋白质含量。按照上述方法对每个样品分析三次。脂多糖(LPS)污染通过鲎阿米巴细胞溶胞产物(limulus amebocytes lysate, LAL)试验进行检测。

1.3 肺癌肿瘤模型制备及用药

取4～5周龄C57BL/6小鼠，每只小鼠腹股沟皮下注射2×107个Lewis肺癌细胞并随机分成5组，每组10只。两天后，分别灌胃0 mg/kg、25 mg/kg、50 mg/kg、75 mg/kg和100 mg/kg芹菜多糖(药物体积均为500 μl)，共用药10 d。取肿瘤组织拍照并称重。

1.4 小鼠免疫反应的检测

荷瘤小鼠给药10 d后，取从眼球静脉采集小鼠血液，用小鼠淋巴细胞分离液通过密度梯度离心法分离小鼠外周血单个核细胞。经FITC-CD4+和PE-CD8+抗体染色后，用流式细胞仪分析小鼠外周血中CD4+和CD8+细胞的百分比。取鼠脾，置于滴加生理盐水的无菌纱布上，用注射器柄研磨脾，获取单个脾淋巴细胞。1 000 r/min离心5 min回收单个脾细胞，加入5 ml红细胞裂解液，混匀后于冰上裂解5 min，1 000 r/min离心5 min以回收脾淋巴细胞，并经5 ml生理盐水清洗2次。1 000 r/min离心5 min回收细胞，利用Trizol提取淋巴细胞RNA。所提取的RNA经Nano drop 2000定量后，采用SuperScript® III First-Strand Synthesis System逆转录成cDNA。以β-actin作为内参，qPCR法分析IL - 2、IFN -γ和IL - 4 mRNA的水平。

1.5 统计学处理

2 结果

2.1 芹菜多糖的特性

红外光谱和凝胶渗透色谱法的结果证实本实验组所提取的芹菜多糖的纯度为82%，同时凝胶渗透色谱结果中出现两个峰，表明芹菜多糖是一种不均一的多糖，该多糖的分子量为1.17×103kD。

2.2 芹菜多糖抑制肺癌的作用

将芹菜多糖以0、25、50、75、100 mg/kg的浓度灌胃荷Lewis瘤C57BL/6小鼠。结果显示，与0剂量组相比，芹菜多糖以剂量依赖的方式抑制Lewis肺癌的生长(图1)，表明芹菜多糖具有很强的抗肺癌作用。

Fig. 1 PSC inhibited lung cancer growthinvivo(n=10)

1： PBS treated group; 2-5： 25 mg/kg, 50 mg/kg, 75 mg/kg, 100 mg/kg of PSC treated group

2.3 芹菜多糖增强了小鼠的免疫反应

有研究显示，植物多糖在调节免疫系统方面具有很强的活性[10]。为了研究芹菜多糖是否能调节小鼠的免疫反应，我们分析了经芹菜多糖(0 mg/kg或75 mg/kg)治疗10 d后的小鼠外周血中CD4+和CD8+细胞的百分比。结果证实，小鼠外周血中CD4+和CD8+细胞经芹菜多糖治疗后都显著增加，即芹菜多糖治疗组小鼠的免疫应答显著增强(图2)。此外，qPCR检测结果显示，25～100 mg/kg芹菜多糖治疗组小鼠脾淋巴细胞产生细胞因子IL - 2、IFN -γ和IL - 4的mRNA表达上调，且IL - 2、IFN -γ和IL - 4表达水平与用药剂量有关，其中IL - 2和IFN -γ的升高水平明显高于IL - 4，结果见图2、表1。所有这些数据表明芹菜多糖可以增强免疫反应，尤其是细胞免疫，这可能有助于其发挥抗肺癌的功能。

Fig. 2 PSC up-regulated CD4+and CD8+cells in peripheral blood of mice(n=10)

*P**PvsPBS treated group

GroupIL-2/β-actinIFN-γ/β-actinIL-4/β-actinPBS0.44±0.030.56±0.020.65±0.0525 mg/kg PSC0.84±0.011.73±0.07∗∗0.82±0.0450 mg/kg PSC1.28±0.05∗∗2.62±0.10∗∗1.05±0.09∗∗75 mg/kg PSC1.90±0.09∗∗3.05±0.14∗∗1.29±0.14∗∗100 mg/kg PSC2.72±0.17∗∗3.43±0.12∗∗1.51±0.11∗∗

**P<0.01vsPBS treated group

3 讨论

目前，已有一些植物多糖被证实具有抗肿瘤的活性并被应用于临床[10]。一些研究表明，药用植物多糖的抗肿瘤作用主要是由于其免疫调节活性。一些药用植物的多糖通过上调免疫细胞，如T淋巴细胞和NK细胞，增强免疫反应[11]。已经证明，当归和火棘多糖可以增加外周血细胞和脾细胞中CD4+细胞的百分比和CD4+/CD8+比率[12, 13]。此外，来自药用植物的多糖也有助于细胞因子的增加。例如，当归和火棘多糖能够增加外周血细胞和脾细胞中IL - 2的产生。诺尼果果汁中的多糖可以刺激TNF -γ、IL - 1和IL - 10的释放，抑制肺癌生长，并提高肺癌小鼠的存活率[14]。最近，Chen等人报道羊栖菜多糖通过调节肿瘤免疫反应[15]，如上调腹膜巨噬细胞产生IL - 1和TNF -γ，增加脾细胞增殖，在肺癌中具有强大的抗肿瘤活性。

芹菜是一种家喻户晓的食药两用植物，包括水芹、旱芹、西芹三种，这三种芹菜功能相近，药用以旱芹为佳，旱芹被称为“药芹”。芹菜富含丰富的蛋白质、碳水化合物、胡萝卜素、B族维生素、铁、钙、磷、铁、钠、磷等，同时，有平肝清热，凉血止血，祛风利湿，除烦消肿，凉血止血，解毒宣肺，祛风利湿，健胃利血、清肠利便、润肺止咳、降低血压、健脑镇静的功效，至今未发现芹菜有毒副作用。芹菜中含有多糖成份，但该多糖是否具有防治肺癌的作用及其潜在作用机制尚未见报道。本研究提取和纯化了芹菜多糖，并探讨了该多糖对肺癌发生发展的作用和相关机制。研究结果表明，芹菜多糖可通过上调小鼠外周血中CD4+和CD8+细胞的百分比以及脾淋巴细胞中细胞因子IL - 2、IFN -γ和IL - 4水平来提高小鼠的免疫水平，尤其是细胞免疫水平，从而对肺癌Lewis细胞在小鼠体内的增殖进行抑制。

芹菜培养条件要求不高，价格便宜。芹菜多糖成份在芹菜中占比较高，易提取和保存，能被患者所接受。因此，芹菜多糖抗肺癌生物功能及相关机制的发现，必将为其进一步抗肺癌的临床应用打下坚实的基础。