基于HMGB1/TLR4信号通路评价五味子乙素对2型糖尿病肾病大鼠肾脏功能的保护作用

熊 刚 邹 华 胡承莲 吴 丹 邓贵柳

糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)为糖尿病中最常见的并发症之一，也是引起终末期肾病最主要的诱导因素，调查发现约30%患者进一步会恶化为糖尿病肾病阶段[1]。DN发病早期主要表现为肾小球滤过能力增高及尿中出现微量白蛋白，如果未能得到及时治疗会出现肾小球萎缩、基膜增厚及细胞外基质堆积，进一步引发慢性肾功能不全，直接影响患者的生存质量[2]。倘若对DN疾病发展早期进行及时干预，会改善尿中微量蛋白流出，防止患者进入临床蛋白尿期。一旦患者疾病恶化为临床蛋白尿期，患者的肾脏功能将会受到急剧损伤，所以研究DN早期治疗的方法具有重大临床意义[3]。高迁移率族蛋白1(HMGB1)属于一种核内非组蛋白染色体结合蛋白，可通过与胞膜上Toll样受体4(TLR4)结合从而激活核转录因子-κB(NF-κB)，进一步诱导炎性信号的活化，导致细胞出现炎性反应[4,5]。

五味子乙素(schisandrin B，SchB)是从五味子中提取分离得到的木质素类天然活性化合物，表现出显著的抗氧化、抗炎症及抗细胞凋亡的作用，它可以通过抑制细胞内炎性通路活化达到对心脏、大脑、肝脏及肾脏等组织的保护作用[6～8]。目前，SchB对DN大鼠的保护作用及其对HMGB1/TLR4信号通路的相关作用不明确，本研究探讨了SchB对DN大鼠肾脏功能及HMGB1/TLR4炎性通路活化的影响，以期为DN早期治疗提供新的研究思路。

材料与方法

1.动物及试剂：200～250g雄性SD大鼠40只(辽宁长生生物技术有限公司，实验动物合格证SCXK2010-0005)，分笼饲养于屏障环境中。五味子乙素(山东绿叶制药，批号H2011051108，纯度≥98%)，链脲佐菌素(美国Sigma公司)；HE染色试剂盒(武汉博士德生物技术有限公司)；HMGB1(货号CZ-20170614)、TLR4(货号ab0252411)、IL-1β(货号ab1025855)、IL-6(货号ab1102239)、TNF-α(货号ab2252172)及β-actin(货号ab2255027)单克隆抗体购自英国Abcam公司。

2.DN模型构建及药物治疗：采用尾静脉注射链脲佐菌素构建DN模型，3天后检测大鼠血糖浓度，其中血糖浓度≥16.65mmol/L的大鼠作为实验组。实验组动物给予低(15mg/kg)、高(30mg/kg)剂量SchB灌胃，1次/1天，连续4周。正常对照组及DN组大鼠给予同体积生理盐水灌胃。

3.生化指标检测：大鼠灌胃4周后，收集各组大鼠24h尿液。采用适量的10%水合氯醛麻醉大鼠后，每只采取3ml，静置于冰上2h后3000×g离心5min，吸去血清转移至无菌Ep管内。采用全自动生化分析仪(西门子)测定各组大鼠ALT、Ucr、Scr、Cys-c及Ccr值。

4.HE染色实验：采血结束后开腹收集大鼠肾脏组织，用生理盐水反复冲洗至颜色变白，将左侧肾脏组织修饰为5mm×5mm×5mm的组织块，放入4%甲醛中固定，用于HE染色。右侧肾脏组织立即放入-80 ℃冰箱用于Western blot法实验。

5.Western blot法检测：称取肾脏组织10mg，在冰上用碾磨器搅碎后4℃、13000×g离心15min，吸取蛋白上清至新Ep管中，采用BCA试剂盒进行蛋白浓度测定，加入适量上样缓冲液混匀，100℃煮沸7min。用12%的SDS-PAGE凝胶块电泳分离蛋白，完成后转膜。切割不同分子量目的蛋白至对应一抗溶液中(稀释比均为1∶3000)，4℃震荡过夜，采用HRP标记的二抗(稀释比1∶1000)37℃孵育1h，TBST洗膜3次后加入ECL显影液，采用X光胶片曝光。

结 果

1.五味子乙素对DN大鼠肾脏功能指标的影响：五味子乙素治疗对DN大鼠肾功能指标影响结果如表1所示，提示DN组Scr、Cys-c及ALT水平相对于正常对照组显著升高(P<0.05)，而Ucr、Ccr水平则显著降低(P<0.05)，实验大鼠DN模型构建成功。但是经过低、高剂量五味子乙素治疗后，大鼠Scr、Cys-c及ALT水平相对于DN组显著降低(P<0.05)，而Ucr、Ccr水平明显升高(P<0.05)。

表1 各组大鼠Scr、Ucr、Ccr及Cys-c比较

2.五味子乙素对DN大鼠肾脏组织形态的影响：大鼠肾脏组织形态观察发现正常对照组肾脏组织结构正常，DN组肾小球有一定程度萎缩，组织结构排列不均匀，并且有肿胀，脱落现象，还存在空泡样变性，鲍曼囊腔扩；而经过高剂量五味子乙素治疗后，可改善上述不良形态,详见图1。

图1 各组间大鼠肾脏组织形态比较(HE染色，×200)

3.五味子乙素对DN大鼠肾脏组织HMGB1/TLR4通路的影响：五味子乙素治疗对DN大鼠肾脏组织HMGB1/TLR4通路影响结果如图2、表2所示，提示DN组HMGB1、TLR4蛋白表达水平相对于正常对照组显著升高(P<0.05)，而经过低、高剂量五味子乙素治疗后，大鼠肾脏组织HMGB1、TLR4蛋白表达水平相对于DN组显著降低(P<0.05)。

图2 各组间大鼠肾脏组织HMGB1、TLR4蛋白表达比较

表2 HMGB1、TLR4蛋白表达水平

4.五味子乙素对DN大鼠肾脏组织炎性因子的影响：如图3、表3所示，DN组IL-1β、IL-6及TNF-α蛋白表达水平相对于正常对照组显著升高(P<0.05)，而经过低、高剂量五味子乙素治疗后，大鼠肾脏组织IL-1β、IL-6及TNF-α蛋白表达水平相对于DN组显著降低(P<0.05)。

图3 各组间大鼠肾脏组织炎性蛋白表达比较

表3 IL-1β、IL-6及TNF-α蛋白表达水平

讨 论

糖尿病属于一种常见的内分泌代谢紊乱性疾病，然而DN为糖尿病较为常见的并发症之一，最后也许恶化为慢性肾功能不全及终末期肾衰竭，会给患者及家庭带来极大的影响[9]。DN主要为血糖急剧升高外，还常伴随着蛋白质及脂肪等代谢异常及肾脏组织病变[10]。五味子常用于滋补的中药，性味温和，对人体心脏、肝脏、脾脏、肺及肾脏起着平衡作用，还属于补益类及镇静类中药，然而对其成分提取发现木质素的药理活性最强，其中SchB是最主要的活性化合物之一。已有研究发现SchB能通过抑制TGF-β/Smad信号转导起到抗肾纤维化的作用[11]。原丽欣[12]研究发现SchB可通过增强SOD及GSH-Px等抗氧化酶活性，改善活性氧(ROS)所致肾组织的氧化损伤。但是SchB对糖尿病所致肾病的保护作用尚未见相关研究。本研究采用尾静脉注射链脲佐菌素构建DN模型，发现大鼠Scr、Cys-c及ALT水平显著升高，而Ucr、Ccr水平显著降低，说明DN组大鼠肾脏功能受到严重损伤。通过给予低、高剂量SchB治疗4周后，上述生物学指标均得到明显改善，并且肾脏组织形态也得到部分改善，由此提示SchB对糖尿病所致肾病大鼠的肾脏功能具有改善作用。

在DN发病过程中，疾病早期肾小球及间质会出现巨噬细胞及T细胞浸润，白细胞产生IL-1β、IL-6及TNF-α等促炎性因子，后者进一步诱发肾脏细胞产生多种趋化因子，引发新一轮的炎性反应[13]。HMGB1能与细胞膜上TLR2及TLR4受体相互作用，活化细胞内炎性通路，诱发炎性因子的大量产生。早期发现糖尿病患者TLR4表达量显著增高，能诱导下游分子NF-κB转入细胞核内，促使炎性基因的转录，进一步导致肾脏受损[14]。糖尿病患者常出现肥胖、胰岛素抵抗及氧化应激增强等病症，还发现存在热休克蛋白60及游离脂肪酸的含量升高，从而活化TLR4/NF-κB炎性转导信号，诱导大量细胞因子及炎性介质的产生，导致炎性损伤[15～17]。由于TLR4介导下胞内各信号转导相互作用，共同加剧ND疾病的发生、发展。

本研究中低、高剂量SchB组与DN组大鼠比较，HMGB1及TLR4蛋白表达量显著降低。前期研究发现，SchB可通过抑制TLR4/NF-κB/MyD88信号通路活化进而降低神经炎性反应及改善脓毒症，说明SchB可以下调TLR4蛋白表达[18]。然而SchB对HMGB1蛋白表达的报道较少，本文结果提示SchB同样可以降低HMGB1蛋白表达，进一步抑制其下游基因TLR4的活化，但是SchB是否可以直接作用于HMGB1蛋白尚需进一步研究。研究还发现SchB可诱导炎性因子IL-1β、IL-6及TNF-α的表达量的降低，HE染色发现SchB对肾脏组织具有保护作用，提示SchB可能通过抑制肾脏HMGB1及TLR4的表达进而抑制炎性通路的活化，降低细胞因子和炎性介质的产生，发挥对DN大鼠肾脏的治疗作用，然而SchB对炎性转导信号通路的影响机制还有待于深入探讨。