标本配穴电针预处理对脑缺血再灌注损伤大鼠海马沉默信息调节因子1的影响

李丹,陈泽斌,殷妮娜,郑丹,龙漫,谢俊



标本配穴电针预处理对脑缺血再灌注损伤大鼠海马沉默信息调节因子1的影响

李丹,陈泽斌,殷妮娜,郑丹,龙漫,谢俊

(湖北中医药大学,武汉 430061)

基于沉默信息调节因子1(silent information regulation 1, SIRT1)途径探讨标本配穴电针预处理抗脑缺血再灌注损伤的作用机制。将60只雄性SD大鼠随机分为A组、B组和C组,每组20只。A组仅分离右侧颈总动脉,不给予其他处理;B组采用改良的MCAO线栓法制备大鼠右侧局灶性脑缺血再灌注损伤模型;C组造模前取百会、肾俞、三阴交行电针预处理。比较各组再灌注3 h后神经行为学评分,并采用TTC染色法测定脑梗死容积百分比,采用HE染色法观察海马神经元形态,采用Western-blot方法检测SIRT1和过氧化物酶体增殖物活化受体g共激活因子-1a(peroxisome proliferator-activated receptorgcoactivator-1a, PGC-1a)蛋白表达。C组神经行为学评分和脑梗死百分比较B组均显著降低,SIRT1和PGC-1a蛋白表达较B组均显著升高,两组比较差异均具有统计学意义(＜0.01)。标本配穴电针预处理可能通过上调内源性脑SIRT1和PGC-1a蛋白表达而减轻脑缺血再灌注损伤。

针刺疗法;电针;缺血再灌注损伤;沉默信息调节因子1;过氧化物酶体增殖物活化受体g共激活因子-1a;大鼠

缺血性脑血管病已逐渐成为我国老年人死亡的首位原因,该类疾病最有效的治疗方法是恢复梗死区的血流灌注,但由此引发的再灌注损伤问题也随之突显出来。有研究报道,电针预处理能减轻再灌注损伤[1]。而越来越多的研究表明,沉默信息调节因子1(silent information regulation 1, SIRT1)可以参与对抗脑缺血再灌注损伤[2-3],已成为目前研究脑缺血再灌注损伤发病机制的重要切入点。本实验基于SIRT1途径,观察标本配穴电针预处理对脑缺血再灌注损伤模型大鼠海马组织SIRT1及其下游过氧化物酶体增殖物活化受体g共激活因子-1a(peroxisome proliferator- activated receptorgcoactivator-1a, PGC-1a)蛋白表达的影响,探讨其抗脑缺血再灌注损伤的可能分子机制,现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级雄性Sprague Dawley(SD)大鼠60只,体重为220～240 g,由三峡大学实验动物中心提供[许可证号SCXK(鄂)2012-0068]。

1.2 主要试剂与仪器

SIRT1抗体、PGC-1a抗体、山羊抗兔抗体[J0314、p038493、S0918,圣克鲁斯生物技术(上海)有限公司];TTC[A610558-0025,生工生物工程(上海)股份有限公司];SDS-PAGE凝胶制备试剂盒、蛋白抽提试剂盒(140205、140117,谷歌生物科技有限公司);Bradford蛋白浓度测定试剂盒(140105,碧云天生物技术研究所)。

3600线栓(广州佳灵生物技术有限公司);台式高速冷冻离心机[FC5515R,奥豪斯国际贸易(上海)有限公司];电泳仪、转移电泳仪槽、垂直电泳槽(北京市六一仪器厂);暗匣(广东粤华医疗器械厂有限公司); HANS-200电针治疗仪(北京华运安特科技有限责任公司);0.30 mm×25 mm无菌针灸针(苏州医疗用品厂有限公司)。

1.3 造模方法

采用2%戊巴比妥钠溶液(3 mL/kg)腹腔麻醉固定,沿颈部正中剪1个长约2 cm的切口,向右纵行逐层钝性分离,在近前斜角肌端处游离右侧颈总动脉(common carotid artery, CCA)及其分支颈内动脉(internal carotid artery, ICA)和颈外动脉(external carotid artery, ECA),术中注意保护迷走神经。在近CCA分支端3 mm和6 mm处的CCA上分别打1个虚结和死结,在虚结和死结间剪1个约0.2 mm的楔形小口,插入线栓,向下缓慢推进经CCA、ICA入颅,线栓黑色标记完全过分叉处且有一定阻力即止。缺血2 h后,再灌注3 h。采用5级4分评分标准对各组大鼠进行神经功能评分评估,以大鼠麻醉清醒后神经功能障碍1～3分为有效模型[4]。

1.4 动物分组与处理

采用查随机数字表法将60只大鼠随机分为A组、B组和C组,每组20只。

A组仅分离右侧CCA,不给予其他处理。

B组采用上述改良MCAO线栓法缺血2 h后行再灌注3 h,制备大鼠右侧局灶性脑缺血再灌注损伤模型。

C组造模前取百会及双侧肾俞、三阴交穴进行电针预处理。穴位定位参照《大鼠穴位图谱的研制》[5],其中百会位于大鼠顶骨正中,肾俞位于第二腰椎下两旁,三阴交位于后肢内踝尖直上10 mm。采用2%戊巴比妥钠溶液(3 mL/kg)行腹腔麻醉,选用0.30 mm×25 mm毫针进行针刺,要求百会经皮斜刺2 mm,肾俞直刺6 mm,三阴交直刺4～5 mm。同侧肾俞和三阴交接1对电极,百会与辅助电极(于百会前方提捏皮肤浅刺0.5 mm)接1对电极,连接HANS-200电针治疗仪,采用疏密波,频率为2/100 Hz,电流强度为1 mA,通电10 min后留针5 min。连续重复操作4次,共计1 h。预处理结束后再观察30 min,然后行造模手术。

1.5 观察指标

1.5.1 神经行为学评分

再灌注3 h后,参照Longa EZ等[4]的5级4分评分标准对各组大鼠的神经行为学进行评分,以评估大鼠局灶性脑缺血再灌注模型的效果及稳定性。0级(0分)为无神经功能丧失;1级(1分)为左前肢不能充分伸展;2级(2分)为向左环行运动,轻度局灶神经功能丧失;3级(3分)为向左侧倒,中度局灶神经功能丧失;4级(4分)为不能自然行走,重度局灶神经功能丧失。

1.5.2 脑梗死容积百分比

各组随机选取10只大鼠,麻醉后断头取全脑,放入-20℃冰箱冷藏15 min后,沿冠状面切成厚度基本相同的5片,然后立即进行TTC染色,孵育,多聚甲醛固定。分离苍白区(梗死区)和非苍白区(正常区),参考相关文献[6]的方法,计算脑梗死百分比。脑梗死百分比(%)＝[苍白区重量/(苍白区重量+非苍白区重量)]×100%。

1.5.3 海马神经元形态

各组随机选取4只大鼠,麻醉后用4%多聚甲醛灌注固定,石蜡包埋,在海马齿状回层面连续冠状切片,常规脱蜡至化。每只大鼠选2张切片做苏木精-伊红(hematoxylin-eosin, HE)染色,光镜下观察海马CA1区神经元形态。

1.5.4 SIRT1和PGC-1a蛋白表达

各组随机选取6只大鼠,麻醉后断头取全脑,各组取100 mg等量脑组织块用冷TBS洗涤后于冰上彻底匀浆,将匀浆液转移至1.5 mL离心管中振荡、冰浴30 min,待细胞完全裂解后离心5 min收集总蛋白溶液;采用Bradford方法测定总蛋白,并制作标准曲线测定样品浓度;各组取40mg总蛋白加入5×蛋白上样缓冲液进行SDS-PAGE电泳;在预先甲醇活化的0.45mmPVDF膜上转膜;脱色转好的膜用5%的脱脂牛奶封闭1 h后加入的一抗(稀释1:500)4℃过夜,洗膜后加入二抗HRP山羊抗兔(稀释1:3000)室温孵育30 min脱色洗涤,最后用保鲜膜塑封,X光片夹中曝光,根据不同的光强度调整曝光的条件,显影和定影;以Alpha软件处理系统分析目标带的光密度值。

1.6 统计学方法

所有数据采用SPSS19.0软件进行统计分析。符合正态分布的计量资料以均数±标准差表示,组间比较采用单因素方差分析。以＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠神经行为学评分比较

由表1可见,A组无神经功能丧失,C组神经行为学评分与B组比较,差异具有统计学意义(＜0.01)。

表1 各组大鼠神经行为学评分比较 (±s,分)

注:与B组比较1)＜0.01

2.2 各组大鼠脑梗死百分比比较

由图1、表2可见,A组未见脑梗死灶,B组脑梗死灶明显,C组脑梗死灶较B组明显减少。C组脑梗死百分比与B组比较,差异具有统计学意义(＜0.01)。

图1 各组大鼠脑梗死灶比较

表2 各组大鼠脑梗死百分比比较 (±s,%)

注:与B组比较1)＜0.01

2.3 各组大鼠右侧海马神经元形态比较

由图2可见,与A组比较,B组大部分神经元肿胀变形,排列紊乱,神经元数量减少,细胞间质水肿疏松;与B组比较,C组仅少部分神经元肿胀变形,排列尚整齐,细胞间质水肿疏松不明显。

图2 各组大鼠右侧海马神经元形态变化(HE染色,×200,n=4)

2.4 各组大鼠SIRT1和PGC-1a蛋白表达比较

由图3、表3可见,与A组比较,B组海马SIRT1和PGC-1a蛋白表达明显减少,两组比较差异均具有统计学意义(＜0.01);与B组比较,C组海马SIRT1和PGC-1a蛋白表达明显增多,两组比较差异均具有统计学意义(＜0.01)。

图3 各组海马SIRT1和PGC-1a蛋白成像扫描图

表3 各组海马SIRT1和PGC-1a蛋白灰度值比值比较 (±s)

注:与A组比较1)＜0.01;与B组比较2)＜0.01

3 讨论

脑缺血再灌注损伤属中医学“中风”范畴,其病机为本虚标实。本实验采用标本配穴法[7],选取固护先天之元气的肾俞和后天之胃气的三阴交为本,选善治脑部疾病的百会为标,3穴配伍旨在扶正祛邪。“穴位针刺预处理”是由陈泽斌教授等提出,其目的是通过腧穴鼓舞正气,加强机体抗邪抗病能力,防止或降低病邪对机体侵害,是针灸“治未病”内涵的体现。穴位针刺预处理能启动机体内源性的自我保护机制,减轻随后可能发生的疾病损害[8-11]。从本实验结果可以看出,标本配穴电针预处理能明显减轻脑缺血再灌注损伤,这与前期标本配穴防治其他疾病[12-15]及针灸“治未病”防治脑缺血再灌注损伤研究结果相一致[16-19]。

SIRT1是哺乳动物沉默信息调节因子家族的重要成员,是尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸依赖的去乙酰化酶。SIRT1在中枢神经系统中的皮质、海马、小脑和丘脑的神经元中广泛表达[20]。本实验结果显示,A组海马SIRT1蛋白呈高表达,这与相关文献报道一致。最初研究认为SIRT1主要参与延长生物寿命和“限制热量摄入”相关的生理过程[21-22]。但新的研究发现,SIRT1能参与抗脑缺血再灌注损伤,SIRT1基因敲除小鼠脑缺血再灌注后的脑梗死面积明显增大[23]。此外,不同方法预处理或药物干预,均可激活SIRT1信号通路抑制由脑缺血再灌注引起的神经元凋亡,进而减轻脑组织损伤以及脑功能障碍,保护脑组织及防止病情进一步恶化[3,24]。本实验结果显示,B组海马SIRT1蛋白表达较A组显著减少,提示SIRT1与脑缺血再灌注损伤密切相关。而C组海马SIRT1蛋白表达较B组明显增多,提示标本配穴电针预处理能激活并上调SIRT1蛋白表达。

PGC-1a是一种转录共活化因子,既能增加线粒体生物合成,还可促进线粒体氧化表达。PGC-1a位于SIRT1的下游区,SIRT1通过直接去乙酰化增加PGC-1a活性[25-27],SIRT1/PGC-1a在抗脑缺血再灌注损伤中起着重要作用[28]。本实验结果也发现,不同组别间大鼠缺血侧海马区SIRT1和PGC-1a蛋白表达趋势的一致性。因此推测,标本配穴电针预处理能减轻缺血再灌注的作用可能与其上调内源性SIRT1表达,进而去乙酰化作用增强PGC-1a表达有关。

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Effect of Electroacupuncture Pretreatment with Secondary-primary Point Combination on Hippocampal SIRT1 in Rats with Cerebral Ischemia-reperfusion Injury

,-,-,,,.

,430061,

To explore the action mechanism of electroacupuncture pretreatment with secondary-primary point combination against cerebral ischemia-reperfusion injury by focusing the silent information regulator 1 (SIRT1) pathway.Sixty male Sprague-Dawley (SD) rats were randomized into group A, group B and group C, with 20 rats in each group. Group A only received right common carotid artery separation without any other treatments, while group B was intervened by the modified middle cerebral artery occlusion (MCAO) method to establish the right focal cerebral ischemia-reperfusion injury model, and group C was intervened by electroacupuncture pretreatment at Baihui (GV20), Shenshu (BL23) and Sanyinjiao (SP6) before modeling. Neurobehavioral scores in the three groups were compared three hours after the reperfusion. The percentage of cerebral infarct volume was measured by 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC)staining. The morphology of hippocampal neurons was observed by hematoxylin-eosin (HE) staining. The protein expressions of SIRT1 and peroxisome proliferator-activated receptorgcoactivator-1a(PGC-1a) were examined using Western blotting method.Compared to group B, the neurobehavioral score and the percentage of cerebral infarct volume declined significantly in group C, the protein expressions of SIRT1 and PGC-1aboth increased significantly in group C,and the between-group differences were statistically significant (＜0.05).Electroacupuncture pretreatment with secondary-primary point combination may alleviate cerebral ischemia-reperfusion injury by upregulating the protein expressions of endogenous SIRT1 and PGC-1ain brain.

Acupuncture therapy; Electroacupuncture; Ischemia-reperfusion injury; Silent information regulation 1; Peroxisome proliferator-activated receptorgcoactivator-1a; Rats

1005-0957(2019)13-0050-05

R2-03

A

10.13460/j.issn.1005-0957.2019.13.0050

2018-11-03

湖北省教育厅科研指导性项目(B2017101)

李丹(1988—),女,实验师,博士,Email:648781117@qq.com

谢俊(1980—),女,讲师,Email:466083551@qq.com