豆粕多肽锌螯合物的抗氧化性研究

(徐州工程学院 食品(生物)工程学院， 江苏 徐州 221018)

多肽是涉及生物体内各种细胞功能的生物活性物质，它具有调节机体生理功能和为机体提供营养的双重功效[1]。锌是人体必需的微量元素之一，具有重要的生理功能和营养作用[2]。

螯合物的生物学利用率高于无机金属盐，且无毒副作用，能有效提高其吸收率[3]。多肽-金属离子螯合物的研究始于20世纪 60 年代[4]。近年来国内学者也有一些研究报道，如高素蕴[5]以中性蛋白酶水解豆粕得到的多肽与锌盐络合制备了多肽络合锌，初步研究了其抗氧化作用，结果表明脱脂豆粕多肽络合锌对猪油具有抑制自动氧化的作用。李文军等[6]采用不同方法研究了多肽金属螯合物的抗氧化功能，结果表明其对过氧化物的生成有一定的抑制作用，对氧自由基和双氧水均有很强的消除作用，证明了金属螯合物具有较强的抗氧化作用。

本实验考察了大豆多肽锌离子螯合物的体外抗氧化性能，有着十分重要的研究意义和应用前景。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

豆粕：徐州农贸市场；三氯乙酸、正丁醇、三氯化铁、蒽酮、铁氰化钾、2-硫代巴比妥酸、卵磷脂(大豆)：均为分析纯。

7230G型可见分光光度计 上海精密科学仪器有限公司；DL-5低速大容量离心机 上海安亭科学仪器厂；THZ-C恒温振荡器 江苏太仓市实验设备厂；HJ-3数显恒温磁力搅拌器 常州国华电器有限公司。

1.2 豆粕多肽的提取

酶解温度37 ℃，准确称取1 g胰蛋白酶、3 g豆粕于三角瓶中，加入水，调节pH至8.3，置于恒温振荡器中反应2 h，将酶解液离心，取上清液在100 ℃的沸水中灭酶3 min，离心分离，干燥，待用。

1.3 豆粕多肽与锌离子螯合

采用静态法，在自然pH值、30 ℃、150 r/min条件下，锌离子的初始浓度为5 mg/mL，多肽与锌离子的比值为6∶1，螯合4 h，螯合率为94.82%，螯合后锌离子的浓度为0.2592 mg/mL，螯合率计算见下式：

螯合率=(C0-C)/C0×100%。

式中：C0表示吸附前溶液中锌离子的浓度(mg/mL)，C表示吸附后溶液中锌离子的浓度(mg/mL)。

1.4 抗氧化性能研究

1.4.1 清除羟基自由基(·OH)的活性

参考颜军等[7]的实验方法，采用Fenion反应法。

·OH清除率=(A0-Ax)/A0×100%。

式中：A0表示空白对照液的吸光度；Ax表示加入样品液的吸光度。

1.4.2 清除DPPH·的活性

参考郑善元等[8]的实验方法，采用二苯代苦味肼基自由基(DPPH·) 分光光度法。

DPPH·清除率=(A1-A2)/A1×100%。

式中：A1表示空白吸收值(t=0 min)；A2表示DPPH与样液反应30 min后的吸光度。

1.4.3 还原力的测定

参考聂凌鸿等[9]的实验方法，采用铁氰化钾法。

还原力=(A1-A0)/A0×100%。

式中：A1表示加入提取液的吸光度；A0表示空白对照的吸光度。

1.4.4 对脂质过氧化物的抑制作用

参考张娅芳[10]的实验方法，采用硫代巴比妥酸(TBA)分光光度法。

抑制率=(A对照管-A样品管)/A对照管×100%。

式中：A对照管表示对照管的吸光度；A样品管表示样品管的吸光度。

1.4.5 对亚硝酸盐的清除能力

参考余勃[11]的实验方法，采用盐酸萘乙二胺法。

亚硝酸钠清除率=(A空白-A样品)/A空白×100%。

式中：A空白表示空白管的吸光度；A样品表示样品管的吸光度。

2 结果与分析

2.1 羟基自由基(·OH)的清除能力

羟基自由基是已知最活泼的活性氧自由基，是危害最大的氧自由基，也是引起人体疾病和衰老的主要因素[12]。

图1 豆粕多肽及锌螯合物对·OH的清除作用Fig.1 Scavenging effect of soybean meal polypeptide and zinc chelate on ·OH

由图1可知，多肽与锌离子螯合前后对·OH都有一定的清除作用，在一定浓度范围内，随着浓度的增加，清除率有所上升，均呈现较好的线性关系。多肽清除率的线性方程：y=22.25x+36.271(R2=0.9189)；多肽锌离子螯合物清除率的线性方程：y=35.321x+40.9(R2=0.9278)；茶多酚清除率的线性方程：y=55.25x+37.357(R2=0.9278)，螯合后与螯合前的半数清除率分别为0.19和0.1028，螯合后的清除能力提高了28.86%，但均低于茶多酚。

2.2 DPPH·的清除能力

当 DPPH·与抗氧化剂混合反应时，DPPH·的紫色会随着抗氧化剂量的增加而消退变浅，主要是由于抗氧化剂提供电子和质子传递给DPPH·，生成了颜色较浅的稳定分子态的DPPH，故 DPPH·清除率取决于抗氧化剂供电子或质子能力。

由图2可知，多肽与锌离子螯合前后对DPPH·都有一定的清除作用，随着浓度的增加，清除率有所上升，均呈现较好的线性关系。多肽清除率的线性方程：y=40.786x+35.957(R2=0.9364)；多肽锌离子螯合物与清除率的线性方程：y=78.75x+40.986(R2=0.9479)；茶多酚清除率的线性方程：y=71.857x+41.2(R2=0.9764)。螯合后与螯合前的半数清除率分别为0.869和0.566，螯合后的多肽清除能力比螯合前提高了34.87%，与茶多酚相当。

图2 豆粕多肽及锌螯合物对DPPH·的清除作用Fig.2 Scavenging effect of soybean meal polypeptide and zinc chelate on DPPH·

2.3 还原力的测定

氧化还原反应是细胞内最普遍的生化过程，人体可以通过摄入抗氧化活性物质来维持细胞内的氧化还原平衡。总还原力是抗氧化物质提供电子能力的重要指标之一，测定总还原力可以衡量其抗氧化能力[13]。

由图3可知，多肽与锌离子螯合前后都有一定的还原作用，随着浓度的增加，还原力有所上升，均呈现较好的线性关系。多肽还原力的线性方程：y=2.6768x+0.7456(R2=0.93)；多肽锌离子螯合物还原力的线性方程：y=2.9057x+1.0531(R2=0.9097)；茶多酚还原力的线性方程：y=2.9393x+0.6043(R2=0.9511)。螯合后与螯合前的半数清除率分别为0.19和0.1028，螯合后的豆粕多肽的还原能力比螯合前提高了45.89%，略低于茶多酚。

图3 豆粕多肽及锌螯合物的还原作用Fig.3 Reduction effect of soybean meal polypeptide and zinc chelate

2.4 对脂质过氧化物的抑制作用

油脂发生氧化酸败最终形成过氧化物丙二醛，油脂中添加抗氧化剂，可使油脂的氧化酸败过程受到阻止或延缓，生成的丙二醛含量就会降低，脂质过氧化物的生成量也会被抑制而减少[14]。

图4 豆粕多肽及锌螯合物对脂质过氧化物的抑制作用Fig.4 Inhibitory effect of soybean meal polypeptide and zinc chelate on lipid peroxides

由图4可知，多肽与锌离子螯合前后对脂质过氧化物都有一定的抑制作用，随着浓度的增加，抑制率有所上升，均呈现较好的线性关系。多肽抑制率的线性方程：y=37.571x+28.843(R2=0.9674)；多肽锌离子螯合物抑制率的线性方程：y=56.5x+30.843(R2=0.9164)；茶多酚抑制率的线性方程：y=46.107x+29.529(R2=0.9534)。螯合后与螯合前的半数清除率分别为0.784和0.537，螯合后的豆粕多肽抑制能力比螯合前提高了31.5%，且高于茶多酚14.63%。

2.5 对亚硝酸钠的清除能力

人体每天通过食物和饮水都会摄入一些亚硝酸盐，极其微量的亚硝酸盐对人体的危害可忽略，但是在食品来源和生产环节，都可能会直接或者间接地增加亚硝酸盐在食品中的含量，对人体造成急性或者慢性危害[15]。

图5 豆粕多肽及锌螯合物对亚硝酸钠的清除作用Fig.5 Scavenging effect of soybean meal polypeptide and zinc chelate on sodium nitrite

由图5可知，多肽与锌离子螯合前后对亚硝酸盐都有一定的清除作用，随着浓度的增加，清除率有所上升，均呈现较好的线性关系。多肽清除率的线性方程：y=9.6071x+46.229(R2=0.9278)；多肽锌离子螯合物清除率的线性方程：y=21.143x+46.257(R2=0.7919)；茶多酚清除率的线性方程：y=12.893x+44.943(R2=0.8619)。螯合后与螯合前的半数清除率分别为4.66和2.67，螯合后的豆粕多肽清除能力比螯合前提高了42.71%，且高于茶多酚22.61%。

2.6 抗氧化能力的对比

通过对比图6中豆粕多肽、豆粕多肽锌螯合物及茶多酚对·OH、DPPH·、脂质过氧化物及亚硝酸盐的半数抑制清除率，可知豆粕多肽与锌离子螯合前后均具有一定的抗氧化能力，且清除羟基自由基的能力最强，清除亚硝酸盐的能力最差；清除羟基自由基与DPPH自由基的能力略强于茶多酚，脂质过氧化物的抑制能力与亚硝酸盐的清除能力均低于茶多酚；豆粕多肽与锌离子螯合后其抗氧化能力均有所提高。

图6 豆粕多肽、豆粕多肽锌螯合物及茶多酚抗氧化能力的比较Fig.6 Comparison of antioxidant ability of soybean meal polypeptide,soybean meal polypeptide and zinc chelate and tea polyphenol

3 结论

豆粕多肽对·OH、DPPH·、脂质过氧化物、亚硝酸盐都具有一定的清除和抑制能力，IC50值分别为0.19，0.869，0.784，4.66 mg/mL，具有一定还原能力；而锌离子螯合后的多肽对上述自由基的清除或抑制能力都有所增加，IC50值分别提高了28.86%，34.87%，31.5%，42.71%，还原力比螯合前增加了45.89%，且清除羟基自由基的能力最强，清除亚硝酸盐的能力最差；清除羟基自由基与DPPH自由基的能力略强于茶多酚，脂质过氧化物的抑制能力与亚硝酸盐的清除能力均低于茶多酚。

综上所述，多肽与锌离子螯合后比单纯的豆粕多肽的抗氧化性能有较大提高，还可以成为微量元素的补充剂，为豆粕的开发与利用提供科学依据。