青蒿素对胃癌SGC-7901侧群细胞裸鼠移植瘤生长的影响

刘元，钱军*，郭晨旭，朱超，刘先富，承泽农

（1.安徽省蚌埠医学院第一附属医院肿瘤外科，安徽 蚌埠 233000；2.病理科）

从2015年的中国癌症统计数据中发现，胃癌在恶性肿瘤中的发病率、患者的死亡率仍居于癌症的前列［1］，其治疗主要是手术与化疗的结合，预后不理想。近些年，在基础研究中发现，很多肿瘤细胞中含有一种具有肿瘤干细胞特性的细胞亚群，即侧群（side population，SP）细胞，其具有高分化、自我复制及在体内高成瘤等特性［2-3］。研究发现，SP细胞在肿瘤细胞的耐药、复发方面起着重要的作用，从而导致肿瘤的治疗效果不理想［4-5］。青蒿素是屠呦呦于1971年从黄花蒿中提取，并且对鼠疟原虫的控制效果较好［6］，屠呦呦也因此获得2015年诺贝尔奖。近年来，随着对青蒿素的研究，发现青蒿素具有较强的抗肿瘤活性［7-8］。目前就青蒿素对胃癌SGC-7901 SP细胞裸鼠移植瘤生长的影响报道较少，本实验拟探究SP细胞的高致瘤性及青蒿素对各组移植瘤生长及凋亡蛋白表达的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF级BALB∕c-nu裸鼠购于北京维通利华实验动物技术有限公司，4周龄，体重（16.6±0.92）g，实验动物许可证号：SCXK（京）2012-0001，均为雌性。

1.2 实验试剂及药材 RPMI-1640不完全培养液、磷酸盐缓冲液（PBS）、青蒿素购于杭州四季青公司，Hocehst 33342染料购于美国Sigma公司，维拉帕米购于上海医药集团有限公司，免疫组化试剂盒购自英国Abcam公司，SGC-7901胃癌细胞株购自南京凯基生物科技发展有限公司。1.3 细胞培养 将胃癌SGC-7901细胞培养在37℃、5%CO2、95%湿度恒温箱中。定期换液、传代。

1.4 胃癌SGC-7901细胞株SP细胞及NSP细胞的分选 取处于对数生长期的细胞，消化、离心后弃上清液，用含2%胎牛血清（FBS）的PBS将细胞数调整为1×106∕ml。取其中2只离心管作为拮抗组，细胞悬液中加入维拉帕米 10 μl∕ml，余下的离心管作为实验组，在每个离心管的细胞悬液中加入 Hoechst 33342 5 μl∕ml，移入培养箱中孵育90 min，15 min振荡一次。孵育后离心5 min，弃上清液，用含2%FBS的PBS将细胞数重悬至1×106∕ml。移至灭菌流式管中，流式细胞仪检测分选，Hoechst 33342在350 nm条件被激发，获得荧光呈双重波长：蓝光402～446 nm；红光650～670 nm，分别收集SP细胞及NSP细胞。

1.5 裸鼠接种细胞悬液的制备 取对数生长期的SP细胞和NSP细胞，消化、离心后弃上清液；用PBS重悬细胞，血球计数板记数活细胞，当活细胞比率＞95%，稀释细胞浓度至5×106∕ml。

1.6 实验分组 取裸鼠20只，随机分为SP细胞组和NSP细胞组，每组10只，取相应的细胞悬液0.2 ml，接种在裸鼠右腋部偏后方皮下，SP细胞组和NSP细胞组再随机分为生理盐水（NS）组、青蒿素（将青蒿素纯品溶解于少量DMSO，再用生理盐水稀释到所需浓度）组。

1.7 裸鼠移植瘤实验 裸鼠接种细胞24 h后，青蒿素组予青蒿素悬液200 mg∕kg灌胃，对照组予0.5 ml NS灌胃，每天1次，连续给药32 d。移植瘤体积有差异后每3 d测量一次移植瘤的长∕短径（a∕b），计算瘤体体积V，V=a×b2∕2。第32天处死裸鼠，剥离瘤体，称取重量，计算抑瘤率，抑瘤率=（对照组相对重量-实验组相对重量）∕对照组相对重量×100%。

1.8 免疫组化检测 Bcl、Bax、Caspase-3、Caspase-9蛋白的表达 将瘤组织固定、脱水、透明、包埋，连续切片；切片脱蜡水化后，作抗原修复，用FBS代替一抗做阴性对照；每张切片加1滴3%H2O2溶液，常温下孵育，PBS冲洗；每张切片滴加1滴相应一抗，常温下孵育，PBS冲洗；每张切片滴加1滴聚合物增强剂（试剂A），室温下孵育，PBS冲洗；每张切片滴加1滴酶标抗鼠∕兔聚合物（试剂B），室温下孵育，PBS冲洗；每张切片滴加1滴新配置的DAB液，显微镜下控制发色，自来水冲洗终止显色，复染、脱水透明、封片。结果判断：（1）阳性细胞百分比（PP）：在400倍的显微镜下，取5个不同视野，每个视野计数3遍，取其平均值，为阳性细胞数，阳性细胞数与该视野中细胞总数的比为阳性细胞百分比。然后取平均值，作为该张切片的PP。无阳性细胞记为0分，PP＜10%记1分；11%～50%记2分；51～75%记3分；＞75%记4分。（2）染色强度（SI）：0分为无色，淡黄色为1分；棕黄色为2分；棕褐色为3分。每张切片的PP×SI为免疫组化评分（IRS）［9］。

1.9 统计学方法 采用 SPSS 20.0软件进行统计学分析，实验结果数据以均数±标准差表示，采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 SP细胞的分选 通过流式细胞术，检测出胃癌SGC-7901细胞中SP细胞所占比为1.53%±0.47%，经维拉帕米拮抗后SP细胞所占比为0.1%。

2.2 青蒿素对移植瘤的影响 移植瘤见于接种细胞后第3天。于第5天移植瘤体积出现差异，差异有统计学意义。SP细胞及NSP细胞青蒿素组移植瘤体积均小于NS组（P＜0.05）；NSP细胞NS组移植瘤体积小于SP细胞NS组（P＜0.05），见表1。SP细胞与NSP细胞青蒿素组的抑瘤率分别为55.02%和47.09%，见表2。

表1 裸鼠移植瘤体积比较（n=5，mm3）

表2 裸鼠移植瘤重量及抑瘤率

2.3 免疫组化检测瘤体中相关蛋白的表达Bcl-2在SP细胞、NSP细胞青蒿素组的表达低于相应NS组；在NSP细胞NS组中的表达低于SP细胞NS组（P＜0.05）；NS组中Caspase-9、Caspase-3、Bax的表达低于相应青蒿素组，在NSP细胞NS组的表达高于SP细胞NS组（P＜0.05），见图1、表3。

图1 凋亡相关蛋白的免疫组化图（SP×400）

表3 凋亡相关蛋白的免疫组化结果（IRS平均分值）

3 讨论

肿瘤细胞对西药的治疗逐渐出现耐药，而这种耐药却很难逆转，对于肿瘤的治疗，也开始转向中药辅助治疗，且中药对肿瘤的治疗有效、副作用低等优势，对肿瘤细胞的抑制作用也得到进一步的了解，通过作用细胞溶酶体、诱导细胞凋亡以及激活机体免疫系统而间接地抑制肿瘤生长［10-13］。

在本次实验中，再次验证了胃癌SGC7901细胞中是含有SP细胞，量较少，结合移植瘤的体积及重量，验证了同等量SP细胞成瘤能力强于NSP细胞。在细胞的线粒体凋亡通路中，蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3和Caspase-9扮演着重要的角色，Bcl-2蛋白家族增加细胞线粒体膜通透性，释放细胞色素C，诱导Caspase-3和Caspase-9发生级联反应，诱导凋亡信号传导，促进细胞凋亡［14-15］。Bcl-2蛋白家族成员包括抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax，在细胞中两者的比例决定着细胞的 凋 亡 与 否［12］。 Caspase-9、Caspase-3 蛋 白 为Caspase家族中的成员，分别为起始和效应Caspase，Caspase-9、Caspase-3蛋白的激活，为细胞凋亡的一个重要特征，当Caspase蛋白高表达时，预示细胞处于一种凋亡状态，从而抑制肿瘤生长［16-17］。所以当移植瘤组织中低表达Bcl-2，高表达Bax、Caspase蛋白时，细胞是处于一种高凋亡状态，肿瘤生长较慢，相反，则利于肿瘤生长。在本实验NS组中，相对于NSP细胞组，SP细胞瘤体组织中高表达Bcl-2，低表达Bax、Caspase-3、Caspase-9蛋白，处于一种低凋亡的状态，利于肿瘤的生长。SP细胞NS组瘤体的体积大于NSP细胞NS组，SP细胞的成瘤强于NSP细胞，与SP细胞处于一种低凋亡状态有关。在SP及NSP细胞组中，青蒿素组的瘤体较NS组小，与瘤体组织中低表达Bcl-2，高表达Bax、Caspase-3、Caspase-9蛋白相关，青蒿素处理后可以逆转细胞的凋亡状态，是细胞由低凋亡状态向高凋亡状态转变，从而抑制肿瘤的生长。

经过本组基础实验发现，胃癌SGC-7901细胞中是含有极少量的SP细胞，而SP细胞具有高成瘤能力，高成瘤的特性与SP细胞处于一种低凋亡的状态有关，青蒿素对SP、NSP细胞裸鼠成瘤具有一定的抑制作用，其机制与通过改变细胞凋亡状态，使细胞处于一种高凋亡的状态有一定的相关性，从而抑制肿瘤的生长。由于目前对于青蒿素的研究尚处于基础实验阶段，确切机制尚待探讨，望不久可以应用于肿瘤临床的治疗。