电子束辐照诱变黑曲霉突变菌株对米酒风味的影响

崔敬爱，邵智韬，戴碧玮，徐 岩，庄若岩，陈晓平*

（吉林农业大学 食品科学与工程学院，吉林 长春 130118）

黑曲霉（Aspergillus niger）是一种安全的应用十分广泛的工业菌种，不仅普遍性的被作为酶制剂，用于生产如葡萄糖淀粉酶、酸性蛋白酶、纤维素酶等酶，还被应用于其他领域，如饲料制造业和畜牧养殖[1-4]。在农业上还用来降解重金属和大分子的有机物，改善土壤的结构，在食品工业中，黑曲霉用于制造醋类、酒类、调味品等，由于黑曲霉出色的糖化能力，在酿酒米酒的过程中，黑曲霉可参与米酒曲的制作[5-8]。

黑曲霉及突变菌株是常见的糖化菌种，为了提高黑曲霉的工业价值，在工业中常对黑曲霉进行诱变育种，诱变方法主要分为物理诱变和化学诱变。常见的物理诱变方式有紫外线、X-射线、γ-射线、离子束等，常见的化学诱变方式有烷化剂（如硫酸二乙酯）、核酸碱基类、抗生素等。

电子束辐照（electron beam irradiation，EBA）是20世纪90年代起开始被广泛使用的技术，不同于传统的γ-射线辐照原理，电子束辐照是经高压电场获得的电子束射线，γ-射线属于不带电的电磁辐射，而由高能电子加速器产生的电子束是带有负电荷的电子，辐射剂量远远高于γ-射线，能够产生很大的突变谱[9-12]。电子直线加速器通过发射电子脉冲让小分子物质分解，从而产生活自由基，与核内物质作用，发生交联反应。近年来，国内外对电子束辐射技术在食品领域的研究主要集中在杀菌保鲜方面，电子束辐照诱变领域的研究相对较少。电子束辐照诱变育种具有辐射损伤低、无污染源、诱发变异频率高、突变谱广等特点，是有着很大发展前景的新诱变源[13-16]。

糯米酒又称醪糟、江米酒、甜酒，是中国重要的传统发酵类食品之一，糯米酒的主要原料是糯米，搭配米酒曲和酵母菌等在多种微生物的作用下酿造而成，风味酸甜醇香，富含多种营养物质，酒精的含量相较于其他酒类少，深受广大消费者的喜爱[17-20]。本研究采用气相色谱-质谱联用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）技术，以黑曲霉原始菌株与电子束辐照诱变的突变菌株酿造的糯米酒作为检测样品，分别检测其挥发性物质，为黑曲霉的工业应用糯米酒的开发与研究，以及电子束辐照诱变育种的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 原料与菌株

糯米、麸皮：市售；黑曲霉（Aspergillusniger）CICC40099原始菌株：中国工业微生物菌种保藏管理中心（china center of industrial culture collection,CICC）；黑曲霉（Aspergillus niger）CICC40099突变菌株：本实验室经电子束辐照诱变育种后得到；酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）：安琪酵母股份有限公司。

1.1.2 化学试剂

氯化钠（分析纯）：无锡市亚泰联合化工有限公司；无水乙醇（色谱纯）：珠海市香洲鹏达化工实业公司；C7～C40正构烷烃标准品（均为色谱纯）：美国o2si公司。

1.1.3 培养基

马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextrose agar，PDA）培养基、察氏液体培养基：南通凯恒生物科技发展有限公司。

1.2 仪器与设备

VF-PROACCEL-10-20电子直线加速器：山东蓝孚高能物理技术股份有限公司；5975C安捷伦气质联用仪：美国安捷伦公司；65-II磁力搅拌器：常州易晨仪器制造有限公司；LD-60KBS高压灭菌锅：苏州奥普实验设备有限公司；2202C恒温摇床、DHG-9146A电热恒温鼓风干燥箱：上海和呈设备有限公司；SPX-250Z型生化培养箱：成都领度仪器有限公司；HD-1360超净工作台：北京东联哈尔仪器制造有限公司；GL-21LM高速冷冻离心机：青岛洋洋装备科技有限公司；DHG-9146A电热恒温鼓风干燥箱；W919血球计数板：泰州为尔康医用品有限公司；FWT-60剂量计：美国远西公司。

1.3 试验方法

1.3.1 样品制备

（1）黑曲霉突变菌株的制备

在30℃条件下，黑曲霉CICC 40099置入察氏液体培养基中活化3 d后，接种到PDA固体培养基上，培养7 d，用生理盐水洗脱固体培养基表面孢子，180 r/min、30℃分散孢子，血球计数板计数，调整黑曲霉孢子悬浮液浓度。电子束辐照在通化蓝孚金汇电子加速器应用有限公司进行，电子直线加速器的额定功率是20 kW，电子束的能量是10 MeV，频率是260 Hz，电子加速器下的传动链速度是1 m/min。辐照过程中使用剂量计进行剂量追踪，剂量计由中国计量科学研究院校准。辐照剂量分别设置为0.1 kGy、0.2 kGy、0.3 kGy、0.4 kGy、0.5 kGy，电子束实测剂量分别为0.11 kGy、0.20 kGy、0.31 kGy、0.39 kGy、0.51 kGy。以上每个剂量三个平行，样品辐射前后均贮藏于4℃冰箱中待测。

（2）原始菌株及突变菌株糖化酒曲的制备

30 g麸皮，30 mL无菌水，置入250 mL锥形瓶摇匀，在121℃高压灭菌25 min，冷却至30℃后，分别接种0.9 g黑曲霉原始菌株及突变菌株孢子粉，35℃条件下静置培养3 d，即得到黑曲霉原始菌株及突变菌株糖化酒曲。

（3）糯米酒的制备

30℃条件下将糯米浸泡在无菌水中24h，水平面的高度超出糯米5 cm，100℃条件下糯米蒸煮30 min，冷却至30℃后分别加入0.6%的原始菌株与突变菌株糖化曲，在30℃条件下糖化24 h，得到原始菌株与突变菌株的糖化液。称取0.4%的酿酒酵母，在34℃的温水中活化15 min后，分别加入两种糖化液中，29℃发酵4 d，过滤澄清后，得到由原始菌株和突变菌株酿造的两种成品糯米酒。

1.3.3 糖化酶酶活的分析

糖化酶酶活力定义：1 mL酶液，在40℃、pH 4.6的条件下，1h水解可溶性淀粉产生1mg葡萄糖，为一个酶活力单位（U/mL）。采用3,5-二硝基水杨酸（dinitrosalicylic acid，DNS）比色法测定糖化酶活力[21]。

1.3.4 米酒挥发性成分分析

样品预处理：取两种成品酒液置入离心管内，13℃、12 000 r/min的条件下，离心10 min，去除杂质，取上清液待测。

气相色谱条件：色谱柱为DB-624毛细管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），载气为氦气（He），载气的流量为20.0mL/min，不分流进样。进样口温度250℃，程序升温：起始温度60℃，保持时间3 min，以6℃/min的速率升至260℃，保持15 min，汽化室温度260℃。进样方式为自动进样。

质谱条件：电子电离（electronic ionization，EI）源，接口温度为280℃，电子能量70 eV，发射电流200 μA，离子源温度250℃，四级杆的温度150℃，传输线温度250℃。质量扫描范围30～550 u，数据采集开始时间0 min。

定性定量分析：用Enhanceddataanalysis软件完成数据处理，挥发物质谱图通过计算机与美国国家标准技术研究所（national institute of standards and technology，NIST）质谱数据库和Wiley标准谱库中进行检索匹配核对定性，采用峰面积归一化法对样品相对定量。

2 结果与分析

2.1 菌株诱变选育

2.1.1 电子束辐照诱变的结果

在额定功率为20 kW，电子束的能量为10 MeV，频率为260 Hz，电子加速器下的传动链速度为1 m/min，辐射剂量分别为0.1kGy、0.2kGy、0.3kGy、0.4kGy、0.5kGy处理后，测得黑曲霉突变菌株的糖化酶活力，结果见表1。

表1 电子束辐照诱变菌株的酶活力检测结果Table1 Determination results of enzyme activities of electron beam irradiation mutagenic strains

由表1可知，经过电子束辐照诱变后，涂板筛选，对菌株进行计数，发现辐射剂量在0.2kGy时，菌株致死率在70%～90%之间，选取5株（命名为Y-1～Y-5），置于察氏培养基培养后，再进行摇瓶发酵，经多次筛选后，测得黑曲霉突变菌株Y-1～Y-5的糖化酶活力，结果见表2。

表2 突变菌株的筛选结果Table2 Screening results of the mutant strains

由表2可知，与原始菌株Y-0相比较，黑曲霉突变菌株Y-1～Y-5的糖化酶活力均有提高（77.28%～100.78%），其中黑曲霉突变菌株Y-3糖化酶活力最高，为1 366.5 U/mL。因此，进一步考察菌株Y-3的遗传稳定性。

2.1.2 遗传稳定性研究

将突变菌株Y-3在察氏固体培养基上传代培养5次，每次传代后测定糖化酶活力，结果见表3。

表3 菌株Y-3遗传稳定性的检测结果Table3 Determination results of genetic stability of strain Y-3

由表3可知，黑曲霉突变菌株Y-3在培养传代5次之后，菌株的酶活力在一定程度上产生了变化，但是变化幅度微小，菌株的酶活力稳定性良好。

2.2 原始菌株Y-0酿造的糯米酒风味物质分析

采用气相色谱-质谱联用法对原始菌株Y-0酿造的糯米酒进行风味物质分析，利用系统谱图库的检索，对照相关文献和查阅标准图谱分析，使用峰面积归一化方法确定了各组分的相对含量。总离子流色谱图见图1，原始菌株Y-0糯米酒的香气成分分析结果见表4。

由表4可知，从原始菌株Y-0发酵糯米酒中共鉴定出了33种挥发性物质，占总挥发性风味物质含量的95.864%，糯米酒的主要成分是醇类、酯类、酸类、醛类、酮类、硅氧烷类等。其中醇类物质9种，共占总含量的70.121%，酯类物质11种，共占总含量的13.590%，酮类物质2种，共占总量的4.011%，醛类物质3种，共占总量的4.522%，酸类物质3种，共占总量的2.442%，硅氧烷类5种，共占总量的2.037%。在醇类物质之中，乙醇的含量最多，占总量的49.956%。酯类中乙酸乙酯的含量最多，占总含量的10.719%。在糯米酒中，醇类和酯类组分所提供的香气最为丰富，乙醇与苯乙醇为糯米酒提供了米酒的醇香气味，苯乙醇带有玫瑰香气，乙酸乙酯、十二酸乙酯、十四酸乙酯、棕榈酸乙酯带有独特的花果香气，辛酸乙酯提供了白兰地酒的香气，2,3-丁二酮和3-羟基-2-丁酮则提供了牛奶与奶油的香气。

图1 原始菌株Y-0发酵糯米酒挥发性成分GC-MS分析的总离子色谱图Fig.1 Total ion chromatogram of volatile components in glutinous rice wine fermented by original strain Y-0 with GC-MS

表4 原始菌株Y-0发酵糯米酒的香气成分GC-MS分析结果Table4 Analysis results of volatile components in glutinous rice wine fermented by original strain Y-0 with GC-MS

续表

2.3 突变菌株Y-3风味物质分析

使用气相色谱-质谱联用法对突变菌株Y-3酿造的糯米酒进行风味物质分析，利用系统谱图库的检索，对照相关文献和查阅标准图谱分析，使用峰面积归一化法确定了各组分的相对含量。总离子流色谱图见图2，突变菌株Y-3发酵糯米酒的香气成分分析结果见表5。

图2 突变菌株Y-3发酵糯米酒挥发性成分GC-MS分析的总离子色谱图Fig.2 Total ion chromatogram of volatile components in glutinous rice wine fermented by the mutant strain Y-3 with GC-MS

由表5可知，从突变菌株Y-3发酵糯米酒中共分离出了33种挥发性物质，占总挥发性风味物质含量的98.401%，其中醇类物质9种，占总含量的67.350%，酯类物质11种，占总含量的17.442%，酮类物质2种，共占总量的4.350%，醛类物质3种，共占总量的4.217%，酸类物质3种，共占总量的2.63%，硅氧烷类4种，共占总量的1.412%。黑曲霉经过电子束辐照诱变再用于酿造糯米酒后，酒体的挥发性风味物质发生了变化。醇类物质共减少了2.770%，其中乙醇含量增加了0.492%，苯乙醇的含量减少了1.535%。酯类物质增加6.723%，其中乙酸乙酯增加了1.328%，乳酸乙酯增加了0.139%，己酸乙酯增加了1.243%，棕榈酸乙酯增加了0.418%，氨茴酸甲酯增加了0.106%，辛酸乙酯增加了0.116%，乙酸苯乙酯增加了0.029%，癸酸乙酯增加了0.137%，十二酸乙酯增加了0.052%，十四酸乙酯增加了0.036%，亚油酸乙酯增加了0.246%。

表5 突变菌株Y-3发酵糯米酒的香气成分GC-MS分析结果Table5 Analysis results of volatile components in glutinous rice wine fermented by the mutant strain Y-3 with GC-MS

醇类与酯类是糯米酒风味的主要来源，醇类物质提供酒类的醇香气味，酯类物质则提供了花果的香气和奶油蜂蜜的香气。经由电子束诱变的黑曲霉突变菌株代谢的机理与酶学性质发生了变化，导致其在糯米酒的酿造过程中酯类产物的产量增加，改变了糯米酒的风味，酒类的香气略微减弱，而花果香气和奶香得到增长，使糯米酒产品更受消费者的欢迎。

3 结论

糯米酒的风味物质中主要包含醇类、酯类、酸类、酮类和醛类物质，其中最多的是醇类物质，醇类物质中以乙醇和苯乙醇的含量最多。酯类物质检测出11种，突变菌株糯米酒中的酯类物质含量增加了6.723%，其中乙酸乙酯增加了1.328%，乳酸乙酯增加了0.139%，己酸乙酯增加了1.243%，棕榈酸乙酯增加了0.418%，氨茴酸甲酯增加了0.106%，辛酸乙酯增加了0.116%，乙酸苯乙酯增加了0.029%，癸酸乙酯增加了0.137%，十二酸乙酯增加了0.052%，十四酸乙酯增加了0.036%，亚油酸乙酯增加了0.246%。能够影响糯米酒风味的挥发性物质成分很多，除醇类和酯类以外，酸类、酮类等含量相对比较少的挥发性物质也在改善酒体风味上有着显著的影响，其中酸类增加了0.180%，酮类增加了1.228%。

通过GC-MS检测后，结果表明，在相同的酿酒条件下，使用经电子束辐照诱变后的黑曲霉突变菌株酿酒，糯米酒的香气成分发了变化，相较于原始菌株酿造的糯米酒，突变菌株糯米酒中的酯类物质含量明显增多，醇类物质变化不明显，酸类和酮类等主要风味物质略有增加，使得突变菌株糯米酒的酒体风味更加浓郁，酒体香气更加丰富宜人。