江苏镇江地区水稻恶苗病菌分离鉴定与对咪鲜胺的抗性分析

周华飞，杨红福，陈宏州，束兆林，姚克兵，庄义庆

(江苏丘陵地区镇江农业科学研究所，江苏 句容 212400)

【研究意义】水稻恶苗病又名水稻徒长病，是亚洲、非洲和北美洲一种常见的水稻病害[1]。近些年由于旱育秧技术和粳稻品种的加速推广，水稻恶苗病菌发病率呈现上升趋势。【前人研究进展】水稻恶苗病菌可造成水稻产量上10 %～20 %的损失，严重时可达50 %，同时导致谷粒变褐等稻米品质下降[2]。1998年浙江永嘉恶苗病大面积爆发，最终统计面积约6500 hm2，损失最高达到产量的15 %。2005年黑龙江恶苗病暴发成灾导致农户直接经济损失超过15万元。近些年来江苏省受该病的影响也在加大，2012年江苏省扬州市水稻田部分田块恶苗病发病率达到80 %，严重威胁水稻产量的安全[3]。在国外以水稻为主的粮食产区，水稻恶苗病带来的威胁同样与日俱增。2002年加利福尼亚统计水稻恶苗病的发病率达到80 %，造成的水稻产量损失达到30 %[4]。水稻恶苗病在韩国的水稻产区同样造成了严重的损失[5]。【本研究切入点】目前水稻恶苗病的防治主要依靠化学药剂，常用药剂为咪鲜胺，主要通过作用于麦角甾醇生物合成途径来达到防治该病的目的[6]。近几年咪鲜胺的田间药效逐年下降，经检测发现水稻恶苗病菌对咪鲜胺已产生一定的抗药性，江苏部分地区的抗药性已经达到很高的水平[7]。【拟解决的关键问题】对于近些年水稻恶苗病菌抗性的产生问题，本研究采集和分离镇江地区98株水稻恶苗病菌，进行种属鉴定，测定其对咪鲜胺的EC50值，检测靶标位点cyp51A位点的突变情况，旨在为延缓和改良抗性产生提供一定的理论基础和实践依据。

1 材料与方法

1.1 供试药剂和菌株

97 %咪鲜胺原药为江苏丘陵地区镇江农业科学研究所植物保护研究室提供，使用甲醇配成2.0×103μg·mL-1母液待用。

供试的水稻恶苗病菌株采集于江苏丘陵地区镇江农业科学研究所实验基地及周围水稻产区，种植水稻品种主要为武运粳21号、运粳23号和运粳24号，镇稻18号等等，种植区常年使用咪鲜胺及其复配制剂来防治水稻恶苗病[8]。

1.2 试验方法

1.2.1 水稻恶苗病菌的分离鉴定 将采自于恶苗病发病田块的晚期水稻植株接种于固体PDA培养基(马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂20 g，pH 7.0)[9]上，28 ℃条件下培养直至菌丝出现，进行单孢分离，将获得的菌株编号保存。将分离的单孢水稻恶苗菌株接种于50 mL液体PDA培养基，在28 ℃条件下培养5～7 d，过滤获取菌丝，烘干菌丝。使用真菌DNA提取试剂盒(EasyPure Genomic DNA Kit，北京全式金生物技术有限公司)提取上述水稻恶苗病菌总DNA，以真菌ITS通用引物(ITS1-5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’，ITS4-5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)[10-13]进行PCR扩增，扩增片段大小为550 bp。总反应体系(50 μl)：DNA，2 μl；TaqBuffer，5 μl；dNTP，4 μl；Taq酶，1 μl；ITS，各1 μl；ddH2O，36 μl。反应条件：95 ℃，3 min；95 ℃，30 s；55 ℃，30 s；72 ℃，1 min，35 循环；72 ℃，10 min；10 ℃ 程序终止。PCR产物片段大小约为550 bp，经凝胶电泳检测确认条带后，送至上海生工生物工程公司进行测序。测序序列经NCBI-BLAST在线比对分析，使用MEGA 4系统发育进化树软件构建NJ进化树，确定上述水稻恶苗病菌的种属关系及优势种群。

1.2.2 水稻恶苗病菌对咪鲜胺的EC50测定 以水稻恶苗病菌菌丝的生长速率为依据的菌丝生长速率法进行测定[14-15]。咪鲜胺原药浓度梯度设置为0.001、0.01、0.1、1和10 μg·mL-1，不添加咪鲜胺药剂的PDA平板作为空白对照CK。在每个平板中央处接种直径为8 mm的水稻恶苗病菌菌碟，在28 ℃条件下培养直至CK处理平板水稻恶苗病菌菌丝铺满整个平板为止。采用十字交叉法测量平板中菌落直径，根据下列公式计算咪鲜胺对水稻恶苗病菌的菌丝生长抑制率和EC50值。抑制率={(对照菌落直径均值-处理菌落直径均值)/(对照菌落直径均值-接种菌饼直径)}×100 %[16]。采用Excel 2013进行数据处理，分别计算药剂对供试菌株菌丝生长抑制的EC50值。

根据陈夕军等[7]确认的江苏13个地区的水稻恶苗病菌对咪鲜胺的敏感性基线EC50为(0.00075±0.00003)μg·mL-1来确定江苏镇江地区水稻恶苗病菌对咪鲜胺抗性倍数(EC50/敏感性基线)，分为低抗(5～10倍)、中抗(10～100倍)和高抗水平(100倍以上)。

1.2.3 水稻恶苗病菌抗咪鲜胺脱甲基酶cyp51A突变位点检测 以水稻恶苗病菌对咪鲜胺EC50大小为依据筛选出抗性和敏感最强的各2株菌株。接种上述4株水稻恶苗病菌于50 mL液体PDA培养基中，28 ℃条件下150 r/min摇培5～7 d，过滤收集菌丝，采用CTAB法提取4株病原菌的全基因组DNA。由NCBI检索获取水稻恶苗病菌cyp51A序列F.fujikuroiB14为靶标序列设计引物cyp51AF(5’-TGTTTCCACTCCTCTACTAC-3’)和cyp51AR(5’-AAGCCTTCCTG CGTTGCC-3’)，PCR扩增大小约为1500 bp的cyp51A片段。总反应体系(50 μl)：DNA，2 μl；TaqBuffer，5 μl；dNTP，4 μl；高保真Taq酶，1 μl；cyp51AF/R各1 μl；ddH2O，36 μl。反应条件：95 ℃，3 min；95 ℃，30 s；54 ℃，30 s；72 ℃，2 min，35 循环；72 ℃，10 min；10 ℃，程序终止。PCR扩增片段经凝胶电泳确认条带，切胶回收纯化片段送至上海生工生物工程有限公司进行测序。测序序列使用BioEdit软件比对差异碱基，确认差异位点。

2 结果与分析

2.1 水稻恶苗病菌的分离

江苏镇江地区采集的98株水稻恶苗病菌经实验室单孢分离和纯化培养，以其菌丝生长形态等表型特征，初步判断全部成功分离上述98株水稻恶苗病菌。

2.2 水稻恶苗病菌的ITS鉴定

分离得到的98株水稻恶苗病菌菌丝DNA经ITS序列扩增得到的片段大小约为550 bp，测序碱基序列在NCBI-Blast数据库比对同源度高的序列，使用系统发育进化树分析确认98株全部是水稻恶苗病菌，如表1所示，其中藤仓镰刀菌[17](Gibberellafujikuroi)90株，层出镰刀菌[18](Fusariumproliferatum)6株，轮枝镰刀菌[19](Fusariumverticillioides)1株，新知镰刀菌[20-21](Fusariumandiyazi)1株。根据系统发育进化树分析可知，江苏镇江地区水稻恶苗病菌优势种群为藤仓镰刀菌，占比为91.8 %，还出现了近些年才被鉴定的新种新知镰刀菌1株。

表1 98株水稻恶苗病菌种属鉴定结果

2.3 水稻恶苗病菌对咪鲜胺的敏感性分析

通过EC50鉴定结果可知，江苏镇江地区水稻恶苗病菌对咪鲜胺抗性水平在0.011～0.175 μg·mL-1。依据抗性倍数划分结果显示全部是抗性菌株，抗性菌株中高抗菌株占77.6 %，中抗菌株占22.4 %，高抗菌株成为江苏镇江恶苗病菌中的优势种群(表2)。

2.4 水稻恶苗病菌抗性位点cyp51A的PCR检测

cyp51A扩增产物大约为1500 bp，测序后使用BioEdit软件分析比对之后，比对结果如图1所示。对咪鲜胺产生显著抗性菌株1、2与无抗性产生的敏感菌株3、4在咪鲜胺作用靶标位点cyp51A序列完全一致，说明水稻恶苗病菌对咪鲜胺产生明显抗性不是由于靶标位点产生的点突变导致，可能是由于其他相关位点的点突变或转录过量表达等非核酸突变类型。

3 讨 论

近年来，水稻恶苗病逐渐成为水稻生产的主要真菌病害之一，世界上水稻主产区包括我国的江苏和安徽等地发生呈现加重趋势，造成稻米产量10 %～20 %的损失。随着稻田旱育秧技术的推广，改善了苗床的透气性，为水稻恶苗病菌繁殖提供有力的条件，加重该病害的发生。此外，该病害可以还可以依附于水稻种表进行传代，药剂浸种处理不彻底将再次加重病害的传播。目前防治该病害除了依靠品种抗性之外，以多菌灵和咪鲜胺为主的化学农药成为最主要的手段[23]。水稻恶苗病菌对多菌灵的抗性十分严重，药效十分差劲。近年来，抗咪鲜胺的水稻恶苗病菌逐渐被发现，咪鲜胺防效同样呈现下降趋势。因此，调查水稻产区水稻恶苗病菌对咪酰胺的抗性水平，分析抗性产生的原因，为抗性改良和研发新型防治水稻恶苗病菌药剂提供理论支持，保证稻米产量及安全。

表2江苏镇江地区水稻恶苗病菌对咪鲜胺抗性调查统计

Table 2 Survey and statistics on the resistance to prochloraz inFusariummoniliforein Zhenjiang, Jiangsu

抗性等级菌株总数抗性菌株数抗性占比(%)高抗987677.6中抗982222.4低抗9800

本研究从江苏镇江地区分离得到98株水稻恶苗病菌，ITS序列[24-25]系统发育进化树确认全部属于水稻恶苗病菌，主要优势种群为有性态的藤仓镰刀菌，还存在少量的层出镰刀菌与新发现的新种新知镰刀菌等，说明江苏镇江地区水稻恶苗病菌种群资源较为丰富，优势致病种群明显，与郑睿等[22]报道一致。本研究测定上述98株水稻恶苗病菌对咪鲜胺的抗性水平，EC50结果显示江苏镇江地区水稻恶苗病菌抗性比例为100 %，抗性菌株中高抗菌株占比77.6 %，说明水稻恶苗病菌对咪鲜胺已产生大规模抗性，且抗性严重，咪鲜胺及其复配药剂药效才呈现逐年下降趋势。郑睿等[22]报道江苏常州地区水稻恶苗病菌对咪鲜胺EC50平均值达到0.253 μg·mL-1，显著高于江苏镇江地区的抗性水平，说明江苏镇江地区咪鲜胺抗性相比其他地区较低，但长期单一使用咪鲜胺及其复配药剂防治水稻恶苗病，定向筛选水稻恶苗病菌抗药性，依旧会导致抗药性急剧加重，我们需要研究抗性产生的原因，延缓抗性产生，或为开发新型药剂提供依据。

咪鲜胺类药剂抑制水稻恶苗病菌等真菌主要途径是抑制麦角甾醇生物合成路径中必不可少的羊毛甾醇14-α去甲基酶(P45014DM，由cyp51A负责合成)[26-28]，该酶主要功能是催化羊毛甾醇的14-α位甲基的剪切，是常用的选择性抗真菌药物设计的靶标位点。赵志华和张锡明等[6,29-30]研究结果显示水稻恶苗病菌对咪鲜胺产生抗性机制与麦角甾醇的合成机制有关，其次是菌体对药剂的排泄作用导致药剂流失而产生抗药性，排泄机制可能与cyp51A的过量表达有关，与cyp51A基因的核酸序列无关。本研究分析了对咪鲜胺最敏感和抗性最严重的各2株水稻恶苗病菌株的cyp51A位点突变情况，结果显示上述4株菌株的cyp51A位点均无明显的点突变或其他类型突变，证明cyp51A位点不是导致水稻恶苗病菌对咪鲜胺产生抗性的原因。

图1 2株抗性最高菌株与2株最敏感菌株cyp51A位点序列比对分析Fig.1 Alignment analysis of two highest resistant strains and two most sensitive strains of cyp51A

4 结 论

江苏镇江地区水稻恶苗病菌以藤仓镰刀菌为优势种群，对咪鲜胺已产生较高抗药性，水稻恶苗病菌抗咪鲜胺机制非cyp51A点突变导致，可能与麦角甾醇合成途径有关，也可能是菌体内cyp51A的mRNA过表达和直接排泄药剂来达到对咪鲜胺产生抗性的目的。