水稻恶苗病抗性研究进展

季芝娟 曾宇翔 梁燕 杨长登

(中国水稻研究所 水稻生物学国家重点实验室，杭州 310006；*通信联系人，E-mail: yangchangdeng@126.com)

1828年，恶苗病首次在日本被发现[5]，但是历经近200年，关于恶苗病抗性研究并无明显突破。要从根本上解决恶苗病的危害，培育抗恶苗病水稻新品种是最经济、有效的途径。本文将从恶苗病抗性鉴定、抗性资源筛选、恶苗病抗性遗传、分子定位以及抗性基因挖掘等方面，对国内外有关恶苗病抗性的研究进行系统综述，展望在恶苗病抗性方面可进一步开展的研究工作，以期为恶苗病抗性研究的深入和抗恶苗病水稻育种提供参考。

1 恶苗病的症状、危害和防治现状

恶苗病又称徒长病，是种传病害，主要通过种子带菌传播，其次也会通过土壤、带病植株等传播[1]。感染恶苗病的水稻植株田间发病症状主要包括：茎或节间表现异常伸长，茎节部位长出不定根，植株变得瘦高细长，叶色变淡，叶夹角变大，分蘖减少，穗子变小，结实率下降甚至死亡(图 1)。恶苗病可导致播种时种子发芽率下降，成熟收获时产量减少，减产可达30%～95%[6-10]；恶苗病菌产生的有毒代谢产物还会带来严重的食品安全问题[11]。

恶苗病是水稻的“癌症”，发病后无药可治，目前主要以播种前化学药剂浸种处理来防治。药剂有效成分有氰烯菌酯、咪鲜胺、多菌灵等 20 种，其中约85%的药剂有效成分为咪鲜胺、多菌灵或者咯菌腈[12]。收集浙江金华、绍兴和嘉兴田间294份藤仓镰孢(F. fujikuroi)小种发现，其对氰烯菌酯的耐药性从2017年的18%提高到了2018年的47%[13]。恶苗病菌对多菌灵[14-15]和咪鲜胺[16]也均已产生抗药性。因此，化学药剂防治易引起恶苗病菌的耐药性，而且药剂使用还会引起环境污染。

图1 恶苗病田间发病症状Fig. 1. Symptoms of bakanae disease in the field.

图2 三种恶苗病菌种群形态特征[19]Fig. 2. Morphological characteristics of three kinds of pathogens of bakanae[19].

2 水稻恶苗病菌分类及其特征

水稻恶苗病致病菌主要是镰孢菌属，为Gibberella fujikuroi复合种，其交配种群主要包括3类[17](图2)，其无性态、有性态和分泌的毒素如表1所示。其中，F. fujikuroi只在亚洲来源的种子中被发现[10]。恶苗病菌产生的的次生代谢产物即分泌的毒素不但能够影响真菌对宿主的侵染，而且对脊椎动物具有毒害作用，如伏马毒素(又称烟曲霉毒素)可以引起动物发生癌变，严重的可以产生如马脑白质软化症、猪肺水肿或大鼠肝癌等病症[18]。

F. fujikuroi产生毒素的水平受不同小种及其外部环境的影响。Suga等[20]对93个来自日本不同寄主源的F. fujikuroi小种用离体培养的方法分析生产伏马毒素的能力，发现有50个小种可产生此毒素，而另外 43个来自不同寄主源的小种则未检测到此毒素。Matić等[21]比较了光源对恶苗病菌产生伏马毒素的促进影响，用白光或蓝光光照/黑暗交替处理，有利于促进F. fujikuroi和F. proliferatum的毒素产生；对F. verticillioides来说，黄色和绿色光源较佳。

在侵染水稻后，恶苗病不同菌种产生的主要物质各不相同，因此导致水稻发病症状也各不相同。其中，F. fujikuroi造成水稻典型的恶苗病徒长症状，F. verticillioides造成水稻黄化和矮化，而F. proliferatum则发病症状不明显[21]。在这些菌种中，只有F. fujikuroi能分泌GA3，且毒性最强；但F. verticillioides和F. proliferatum有些菌株也表现出与F. fujikuroi一样的侵染能力[10]。

Wiemann等[9]报道了第一份高质量的F.fujikuroi基因组序列草图，并且发现F. fujikuroi基因组和其他菌种只有很小部分基因簇具有保守性；而PKS19(聚酮合酶)基因和NRPS31(非核糖体肽合成酶)基因的基因簇为F. fujikuroi所特有。而且，虽然很多菌种中存在GA生物合成基因，但GA合成却只在F. fujikuroi中发生，暗示该菌种在侵染水稻寄主时，存在选择优势。

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表1 恶苗病菌三类交配种群Table 1. Three kinds of mating populations for the pathogen of bakanae disease.

3 水稻恶苗病抗源的筛选和鉴定

3.1 水稻恶苗病抗性鉴定方法

水稻恶苗病抗性资源的筛选和挖掘需要一种可靠稳定且操作简便的鉴定方法，恶苗病抗性鉴定主要包括恶苗病菌的培养、病菌的接种处理以及抗病水平的评价等。

恶苗病抗性的鉴定需培养大量的恶苗病菌。吕彬[22]发现，用 PSA培养基培养恶苗病菌，产孢量最大；在几种天然培养基中，以大麦培养基效果较好。Yadav等[23]分析了恶苗病菌培养的最佳条件，发现温度在20℃、pH值为5.0时，最适合恶苗病菌的生长，菌丝和孢子产量最高；并进一步分析了不同碳源对病菌培养的影响，发现用谷壳做碳源，生长速度最快，而用甘蔗渣做碳源，则孢子产量最高。Gupta等[6]则认为，恶苗病菌生长最适宜的温度为27～30 ℃，而病菌侵染植株、发展病症的最佳温度是35 ℃。

吕彬[22]比较了芽期浸菌接种、立针期喷雾接种、芽期加立针期接种、铺病节诱发、自然诱发和穗期喷雾接种等几种恶苗病菌接种方法，认为芽期浸菌接种法致病效果最佳。Wulff等[10]则采用室温下将表面灭菌的水稻种子直接浸在10 mL浓度为1×105个/mL的菌液中处理18 h，随后播种于育秧盘，27℃下保湿培养；统计种子发芽率，分别于接种后15 d和30 d调查发病率。季芝娟等[24]将种子消毒浸种48 h、催芽24 h后，挑选芽长为一粒谷长的芽谷，在玻璃瓶内接种恶苗病菌，5 d后即可鉴定出恶苗病的抗性水平；该方法在恒温、恒湿、恒定菌液浓度下处理，不易受环境影响，快速简便。Ma等[25]在季芝娟等[24]的接种方法基础上，结合室外鉴定，将处理后的种子播种于田间，2周后统计成苗率，每月记载发病植株数量。

在恶苗病抗性水平的评价上，出现各种衡量指标。有通过发病症状将抗性水平定级[22,26-27]，或基于发病症状统计发病率、健康植株率来衡量抗性水平[11,28]，或分析幼苗徒长比率对不同的抗感水平定级[24]，还有通过调查死苗率来衡量抗感程度[29,30]。季芝娟[31]在恶苗病抗性QTL定位研究中，除了用徒长性状外，试着用苗重的变化来衡量恶苗病的抗性水平，并且发现徒长比率和苗重比率两个性状存在相关性。然而，Ji等[32]发现抗恶苗病材料也会有幼苗徒长的症状，但是四周后抗、感材料的致死率却存在明显差异。Saremi等[33]则通过田间产量变化来评价恶苗病的抗性水平。Chen等[34]通过离体培养感染恶苗病后的植株基部茎秆，发现感病品种再分离出恶苗病菌的频率比抗病品种高，即利用病菌再分离定殖率(colonization rate)作为恶苗病抗性衡量指标。

根据恶苗病菌处理时期和处理部位的不同，本文汇总了7种恶苗病抗性鉴定方法(表2)，主要集中在芽期浸菌接种和干种子直接浸菌接种这两种方法。但由于恶苗病发病症状的多样性和复杂性，即使同一种方法在接种处理的细节和抗性衡量指标上也各不相同。Chen等[35]认为，虽然恶苗病菌在感染植株过程中会分泌出 GA3、镰菌素、赤霉酸、镰刀菌酸等次生代谢物质，造成徒长、黄化、死亡等症状，但除了这些直观的发病症状外，植株对恶苗病菌的敏感度的不同会造成恶苗病菌在植株中的繁殖扩张速度的不同。因此，进行病菌的再分离或通过qPCR技术衡量病菌的定殖水平，是对传统抗性鉴定方法的补充和完善。

表2 恶苗病抗性鉴定方法Table 2. Methods for evaluation of rice bakanae disease resistance.

3.2 抗恶苗病种质资源的挖掘

控制恶苗病危害最经济且环境友好的方式就是培育抗恶苗病的水稻品种。目前水稻恶苗病抗性研究未有较大突破，恶苗病抗性鉴定方法不够完善是一方面，还有一个原因在于很难筛选到高抗或抗恶苗病的水稻品种或材料。

黎定军等[37]对 411个水稻品种及品系三次筛选后，发现高抗的只有Te70，抗病的有IR9等12个品种，其余398个为感病品种，占参测品种的96.8%。郑镐燮等[26]在204份水稻材料中，只筛选出 7份抗或中抗材料，无高抗材料。其他学者也鉴定了部分水稻恶苗病抗源，发现抗恶苗病的材料很少[38-39]。季芝娟等[40]分析了34个常规水稻品种恶苗病抗性水平，发现高感品种有21个，占所有品种的61.76%；浙103、浙鉴21和甬粳18表现为中抗，未发现抗或高抗品种。Ma等[25]利用32份不同矮生基因材料，通过芽期人工接种恶苗病菌和GA3处理，比较了矮生基因型对恶苗病菌和GA3的反应，寻找可能的恶苗病抗源；发现携带sd-1的材料对外源GA3和恶苗病菌均表现敏感；而携带d-1基因型的材料表现为对GA3不敏感，但感恶苗病；所有d-29，sd-6和sd-q(t)基因型材料则对恶苗病菌表现出一定的抗性。Kim等[11]在研究大规模恶苗病抗性筛选方法时，发现 10个品种中有 4个抗恶苗病，其中 Wonseadaesoo不仅抗恶苗病，对GA3也表现为不敏感。

不同类型的水稻品种感染恶苗病的程度不尽相同。优质米水稻比普通米质的水稻更易感染恶苗病菌，但普通米质的水稻仍有 19%左右的发病率[41]。香米品种则比无香味的水稻品种更易感染恶苗病[42]。季芝娟[31]认为，籼稻比粳稻在生物逆境下更能抵御病虫害的侵入。Chen等[35]通过研究也发现，在231份来自70多个国家和地区的水稻种质资源中，籼稻比粳稻更抗恶苗病。

图3 恶苗病抗性相关QTLs的染色体位置Fig. 3. Chromosome position of the bakanae-disease-resistance-related QTLs.

4 恶苗病抗性遗传和分子定位

至今，有关水稻恶苗病抗性的遗传和基因定位研究方面已有一些报道。比如，郑镐燮等[26]对部分水稻恶苗病抗感组合的F2进行了抗感分离比观察，发现抗/感组合的F2以抗病株数较多，但未对F1的抗病进行观察，也未对F2的抗感进行系统的总结。杨长登等[43]利用来自春江 06和 TN1的双单倍体(DH)群体共检测到2个恶苗病抗性相关QTL，分别位于第1和第10染色体上；这是国内外首次对恶苗病抗性进行 QTL定位研究的报道。十年之后，第二篇关于恶苗病抗性QTL定位的报道是Hur等[44]利用近等基因系(NIL)定位的一个主效 QTLqBK1，该QTL位于第1染色体上，解释65%的表现变异。随后，季芝娟[31]利用徒长和苗重表型进行恶苗病抗性QTL定位，共定位到7个QTL，分别为通过徒长表型鉴定的 4个 QTL(qBE1.1，qBE9，qBE1.2和qBE3)，以及通过苗重表型鉴定的 3个QTL(qBW1，qBW3和qBW6)。Fiyaz等[45]利用Pusa 1342和Pusa Basmati 1121的RIL群体，定位了3个恶苗病抗性相关QTL：qBK1.1,qBK1.2和qBK1.3，分别解释4.76%, 24.74%和6.49%的表型变异，其中qBK1.1和 Hur等[44]定位的qBK1为同一个QTL。Lee等[46]进一步精细定位了qBK1，将QTL区间缩小至23.64－23.67Mb；该区间有4个候选基因，分别 是LOC_Os01g41770，LOC_Os01g41780，LOC_Os01g41790和LOC_Os01g41800； 其 中LOC_Os01g41770和LOC_Os01g41780可能正向或负向调控恶苗病抗性；而LOC_Os01g41790在抗感恶苗病品种中都有表达，但表达水平和模式不同；LOC_Os01g41780编码一个细胞色素 P450单加氧酶，是恶苗病抗性的正向调控因子。Volante等[47]利用GWAS技术发现2个与恶苗病感染应激高度相关的基因组片段，分别位于第 1染色体短臂(qBK1_628091)和第4染色体长臂(qBK4_31750955)。Lee等[48]利用抗、感恶苗病的韩国粳稻品种Wonseadaesoo和Junam的RIL群体定位到qBK1WD。随后，Ji等[32]对抗、感恶苗病的韩国粳稻品种Nampyeong和DongjinAD重测序，进一步分析F2的基因型和对应F3后代病菌感染后的表型，在第1染色体上定位到一个主效 QTLqFfR1，LOD值为22.7；利用类似的方法，Kang等[49]在第 9染色体7.24－7.56 Mbp区间定位到主效QTLqFfR9，LOD值达60.3，该区间共有8个候选基因。Chen等[35]利用GWAS技术对231个水稻种质资源定位出包含206个候选基因的14个QTL，其中4个QTL在第1染色体，比例最高；而qBK1.7则与已报道的qBK1和qFfR1共定位；进一步用IR64/日本晴的RIL群体验证了qBK1.7，比较分析qBK1和qBK1.7的物理区间及区间内候选基因，认为Os01g0601625和Os01g0601675和恶苗病抗性相关。

根据以上恶苗病抗性 QTL定位结果，我们绘制出相关QTL区间位置的示意图(图3)，比较它们的物理距离发现，共有4个区域出现多个QTL共定位的情况。例如，第1染色体上，qFfR1定位区间包含qBK1.7、qBK1和qBK1.1；qBE1.2定位区间包含qBK1.4、qBW1、qBK1_628091、qBK1.5和qBK1.2。第6染色体上，qBW6定位区间包含qBK6.3。第9染色体上，qBE9定位区间包含qFfR9。

总之，已有研究通过不同的定位群体，在第1、3、4、6、8、9、10和11染色体上都有定位出 QTL，累计达33个QTL(表3)；其中在第1染色体有15个 QTL，其次分别是在第 3、6、10染色体的各 4个QTL(图3)。然而如此众多的QTL能否真正在育种中利用？

Wonseadaesoo和 YR24982-9-1分别是qBKWD和qBK1的供体亲本，Lee等[48]评估了这两个供体亲本杂交 F4代株系的抗病情况，发现聚合纯合qBKWD和qBK1的F4代株系的未发病植株比例最高，为80.2%；其次为携带单个纯合qBKWD或qBK1QTL的株系，未携带qBKWD和qBK1的株系的未发病植株比例为35.3%。但是，在育种中若要真正发挥QTL的作用，则需要将 QTL导入到别的主导品种，才能更好地评估QTL的育种利用价值。

表3 恶苗病抗性相关QTLTable 3. QTLs related to rice bakanae disease resistance.

5 从组学大数据挖掘恶苗病抗性基因

随着后基因组时代的到来，对水稻相关病害的研究也提升到了功能基因组学水平，从组学角度挖掘和解析恶苗病抗性相关基因是一个大通量且快速的途径，然而关于这方面的报道还很少，目前只有2篇转录组水平的和1篇蛋白质组水平的恶苗病抗性研究结果。

Matić等[36]利用 RNA-Seq技术，比较了抗感恶苗病的水稻品种 Selenio和 Dorella在接种F.fujikuroi前后的转录组水平的变化，发现在抗恶苗病品种 Selenio中，PR1(Pathogenesis-related protein 1)、类萌发素蛋白、糖苷水解酶、促分裂原激活蛋白激酶、WRKY转录因子等上调表达。Ji等[50]利用RNA-Seq技术分析了抗感恶苗病品种93-11和日本晴的转录组表达差异，发现WRKYs，WAK和MAP3Ks基因在转录水平的上调与93-11的恶苗病抗性相关，而且分布在第 1、3、10染色体上的差异表达基因比例最大，这与 QTL定位结果染色体分布高度吻合。另外，Ji等[51]首次报道了水稻恶苗病抗性在蛋白质组学水平上的变化，通过TMT(Tandem Mass Tags)技术鉴定了93-11和日本晴中的214个差异表达蛋白，其中只有11个差异表达蛋白为两个品种共有；水通道蛋白在93-11中极显著上调，上调倍数达100以上，而在日本晴中未见变化，推测该蛋白是抗恶苗病的关键蛋白。

6 展望

6.1 夯实抗性鉴定体系，挖掘高抗恶苗病的种质资源

水稻抗病相关研究最重要、最基础的一个方面就是稳定的抗性鉴定体系，或者说稳定的高抗种质资源。有研究[35]认为，恶苗病发病症状不一定完全反映出水稻的抗性水平。因此，在恶苗病抗性鉴定方面，还需要做更多更细的研究，来获得一个稳定可靠的抗性评价体系，最终筛选获得高抗恶苗病的水稻种质资源，在此基础上，进一步进行抗性基因的挖掘和育种利用。

6.2 结合分子标记辅助选择技术，开展恶苗病抗性遗传育种改良

通过遗传育种方法获得抗或高抗品种是水稻恶苗病抗性育种的根本目标。虽然目前未发现对恶苗病完全免疫的水稻材料或可以育种利用的抗恶苗病水稻资源，但中抗恶苗病的材料也可以成为基础研究的样本；而且不同的水稻品种在田间的恶苗病发病情况还是存在差异的[52]，在育种中有目的地选择不易发病的品种作为骨干亲本，在后代选择中有意识地淘汰易发恶苗病的株系，也能选育出相对抗恶苗病的水稻新品系。

在当前缺少优异抗恶苗病水稻材料的情况下，一方面除了需不断筛选、创制抗病水稻新种质，加强恶苗病抗性的遗传机理、基因定位和克隆以及功能解析等基础研究；另一方面还应充分发掘野生稻或其他近缘属植物中存在的抗病基因资源。对于已经定位出的效应值较大的QTL，可以从分子设计育种的角度，开发紧密连锁的分子标记，导入到水稻主推品种，进行基因聚合育种，评估其在生产上的应用价值，加快基础研究的应用转化速度。

6.3 研究延缓化学药剂耐药性产生的策略

鉴于目前未有对恶苗病完全免疫的水稻品种，对带菌种子进行杀菌剂处理仍是防治水稻恶苗病最有效的措施。目前，国内有130多个药剂制剂(包括单剂和复配剂)登记用于水稻恶苗病防治，约85%的制剂有效成分为咪鲜胺、多菌灵或者咯菌腈，并且制剂多为咪鲜胺或咯菌腈的单剂[12]。多个药剂都已有不同程度的耐药性，农户不得不在水稻浸种时加大药剂的处理浓度，这一定程度上又助长了药剂耐药性的进一步恶化，同时加重了对环境的污染。

研究认为[13,53]，两种或多种药剂混合使用，在防治恶苗病上的效果比单一药剂效果更好；而且可以避免或延缓抗药性的发生与蔓延。因此，在加快恶苗病抗性水稻品种选育的同时，通过不同药剂混配浸种，来防治恶苗病，可以延缓药剂耐药性的产生。

6.4 研发绿色环保、安全的综合防治技术

在水稻抗病防治方面，在缺乏抗病品种时，只能通过化学药剂来防控，但又会面临农药残留、环境污染和病原菌抗药性等问题，而生物防治可以避免这些问题[54]。因此，在恶苗病防控上，还需加强绿色环保、安全的综合防治技术的研究，可以尝试开发微生物农药、生物化学农药、植物源农药等生物农药。李玉洋等[55]从水稻根际筛选到多粘类芽孢杆菌SH15，能影响恶苗病菌菌丝生长。田洁萍[56]应用解淀粉芽孢杆菌 TF28发酵稀释液浸种处理，对恶苗病的田间防效达到了87%以上。Siciliano等[57]研究发现，F. fujikuroi诱导赤霉素和脱落酸的增加，抑制茉莉酸的产生，且只有很低水平的抗毒素含量。因此，如果在抗恶苗病水稻品种中诱导产生抗毒素并从中提取的活性成分分离纯化，是否能拮抗恶苗病菌的入侵和扩繁呢？将提取的纯化物质作用于感病品种，会不会诱导其产生恶苗病的抗性呢？这些也是未来很有意义的探索课题。