灭菌唑与氰烯菌酯复配对水稻恶苗病菌的抑制活性

李美霞, 陈香华, 周长勇, 陈亚丽, 朱春华,曹凯歌, 王建新, 周明国, 段亚冰*,

(1. 江苏徐淮地区淮阴农业科学研究所，江苏 淮安 223001；2. 南京农业大学 植物保护学院 农药系，南京 210095；3. 江苏省南京市六合区春华家庭农场，南京 211500)

水稻恶苗病是由以藤仓镰孢菌Fusarium fujikuroi为优势种群引起的种传真菌病害，在我国各稻区均有发生。发病植株表现为徒长、病苗细高，叶片叶鞘细长、叶色淡黄，根系发育不良；发病植株产生的分生孢子可借助气流和雨水传播，再次侵染谷粒和稻草，形成侵染循环，严重威胁水稻生产安全，部分病苗在移栽前死亡[1]，严重时可造成水稻减产50%以上[2]。病原菌在侵染水稻的同时，还可产生伏马毒素及其他有毒次生代谢产物等，从而影响粮食安全[3-4]。目前由于缺乏抗病品种，生产中仍采用以种子处理为主的化学药剂防治该病害[5]。

灭菌唑 (triticonazole) 属于三唑类杀菌剂，主要用于防治禾谷类作物、豆科作物及果树等真菌病害，对种传病害有特效，且持效期长[6-7]，但我国目前尚未有灭菌唑用于防治水稻恶苗病的相关产品登记。基于此，本研究拟开展灭菌唑对水稻恶苗病菌的室内抑制活性研究及其对水稻的安全性评价，以期为灭菌唑在水稻恶苗病化学防控上登记使用提供理论依据。

氰烯菌酯 (phenamacril) 属于2-氰基丙烯酸酯类杀菌剂，能有效控制由镰孢菌引起的小麦赤霉病、水稻恶苗病和西瓜枯萎病等多种植物病害[8]。研究表明，该药剂对水稻恶苗病防控体现在对菌丝生长有较高的抑制活性，且浸种处理后对水稻整个生长期无不良影响，兼具保护和治疗作用[9]。近年来，随着氰烯菌酯用药历史的延长，水稻恶苗病菌对其的抗药性问题日益加剧[10]。为了降低水稻恶苗病菌对氰烯菌酯的抗性风险，本研究拟进一步开展氰烯菌酯与灭菌唑混配对水稻恶苗病菌的联合毒力测定，以期为科学使用不同浸种剂及延缓水稻恶苗病菌抗性群体的发展提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 供试材料

95%灭菌唑 (triticonazole) 原药及25 g/L 灭菌唑种子处理悬浮剂 (FS)，均由巴斯夫欧洲公司提供；95% 氰烯菌酯 (phenamacril) 原药由江苏省农药研究所股份有限公司提供。原药均用甲醇溶解并配制成1 × 104μg/mL 的母液，置于4 ℃培养箱保存备用。

供试水稻品种为南粳5 055，苏御糯。

马铃薯葡萄糖琼脂培养基 (PDA)：200 g 马铃薯，16 g 琼脂粉，20 g 葡萄糖，加蒸馏水至1 L。

供试菌株：分别从浙江省绍兴地区 (编号为ZJSX-)、江苏省淮安地区 (编号为JSHA-) 及江苏省泰州地区 (JSTZ-) 采集典型水稻恶苗病感病植株，经组织分离和单孢纯化获得菌株，经形态学和ITS 测序鉴定为藤仓镰孢菌Fusarium fujikuroi，于4 ℃培养箱保存，备用。

1.2 试验方法

1.2.1 水稻恶苗病菌对灭菌唑的敏感性测定 采用菌丝生长速率法[11]。随机选取10 株水稻恶苗病菌菌株，将其从4 ℃培养箱中活化转移至空白PDA 平板上，于25 ℃培养6 d 后，用直径5 mm打孔器于菌落边缘约1/3 处打取菌碟，备用。将药剂与PDA 培养基混匀，制成质量浓度分别为0、0.062 5、0.125、0.25、0.5、1 和2 μg/mL 的含药平板，以加入等体积甲醇的PDA 平板作为对照，每浓度重复3 次，整个试验重复3 次。25 ℃恒温培养6 d 后，采用十字交叉法测量菌落直径 (cm)，并计算不同浓度处理下药剂对菌丝生长的抑菌率(I，%)，用DPS 数据处理软件计算毒力回归方程、有效抑制中浓度 (EC50) 及相关系数 (r)。

1.2.2 灭菌唑种子处理悬浮剂对水稻种子发芽率的影响试验 称量25 g/L 灭菌唑种子处理悬浮剂(FS)，分别制备成有效成分质量浓度为60、120和240 μg/mL 的药液；称取50 g 水稻种子，25 ℃恒温于各质量浓度药液中浸泡48 h。每处理重复3 次，以加入等量清水中浸泡的种子作为空白对照，整个试验重复3 次。浸泡完成后，将种子摆放在润湿的双层滤纸上，于25 ℃、相对湿度85%条件下培养，5 d 后各处理随机选取100 粒种子，计算发芽率。

1.2.3 灭菌唑种子处理悬浮剂对水稻株高和鲜重的影响试验 水稻种子处理同1.2.2 节，将浸泡后的各处理种子种于一次性塑料杯中，每处理30 粒种子，21 d 后调查水稻株高和鲜重情况。

1.2.4 水稻恶苗病菌对氰烯菌酯的敏感性测定

随机选取10 株水稻恶苗病菌菌株供试，试验方法同1.2.1 节，PDA 含药平板中氰烯菌酯终浓度 (质量浓度) 分别设置为：0、0.078、0.156、0.312 5、0.625 和1.25 μg/mL，每浓度重复3 次，整个试验重复3 次。

1.2.5 水稻恶苗病菌对氰烯菌酯和灭菌唑复配药剂的敏感性测定 供试菌株为ZJSX-4。将1 ×104μg/mL 的氰烯菌酯母液与灭菌唑母液分别以质量比4 : 1、3 : 1、2 : 1、1 : 1、1 : 2、1 : 3 及1 : 4进行混合，按照表1 中的质量浓度梯度处理，测定氰烯菌酯和灭菌唑复配药剂对水稻恶苗病菌的抑制活性。采用Wadley 法评价联合毒力[12]，计算氰烯菌酯和灭菌唑复配的增效系数 (SR)：SR ＞1.5为增效作用，1.5 ≥ SR ≥ 0.5 为相加作用，SR ＜0.5 为拮抗作用。

表1 水稻恶苗病菌敏感性测定试验中氰烯菌酯和灭菌唑复配药剂的浓度梯度Table 1 Concent ration gradients of the combinations of phenamacril and triticonazole for the sensitivity tests of F. fujikuroi

2 结果与分析

2.1 水稻恶苗病菌对灭菌唑的敏感性

菌丝生长速率法测定结果 (表2) 显示：10 株恶苗病菌株对灭菌唑均表现敏感，EC50值在0.069 2～0.766 1 μg/mL 之间，表明灭菌唑对水稻恶苗病菌菌丝生长具有较高的抑制活性。

表2 水稻恶苗病菌对灭菌唑的敏感性Table 2 Sensitivity of F. fujikuroi to triticonazole

2.2 灭菌唑种子处理悬浮剂对水稻的安全性

南粳5 055 和苏御糯水稻种子经不同质量浓度的25 g/L 灭菌唑种子处理悬浮剂处理后，其发芽率、株高、鲜重指标与清水对照均无显著差异 (P=0.05) (表3)，表明25 g/L 灭菌唑种子处理悬浮剂对水稻安全性良好，可用于水稻恶苗病的化学防治。

表3 25 g/L 灭菌唑种子处理悬浮剂对水稻的安全性Table 3 Safety of 25 g/L triticonazole FS on rice

2.3 水稻恶苗病菌对氰烯菌酯的敏感性

菌丝生长速率法测定结果 (表4) 显示：10 株恶苗病菌株对氰烯菌酯均表现敏感，EC50值在0.007 6～0.262 9 μg/mL 之间，表明氰烯菌酯对水稻恶苗病菌菌丝生长也具有较高的抑制活性。

表4 水稻恶苗病菌对氰烯菌酯的敏感性Table 4 Sensitivity of F. fujikuroi to phenamacril

2.4 氰烯菌酯和灭菌唑复配对水稻恶苗病菌的联合毒力

同样采用菌丝生长速率法测定了氰烯菌酯和灭菌唑各比例复配药剂对水稻恶苗病菌的联合毒力，结果 (表5) 显示：氰烯菌酯与灭菌唑按不同比例复配后的增系数 (SR) 均在0.5～1.5 之间，表明复配表现为相加作用。

表5 水稻恶苗病菌对氰烯菌酯和灭菌唑各复配药剂的敏感性Table 5 Sensitivity of F. fujikuroi to the combinations of phenamacril and triticonazole

3 结论与讨论

水稻恶苗病又称徒长病，是水稻生产中的重要病害之一[13-14]。20 世纪70 年代，苯并咪唑类杀菌剂被广泛用于防治水稻恶苗病，但由于长期使用单一类型药剂，田间水稻恶苗病菌抗药性迅速发展，早在1982 年日本即报道了水稻恶苗病菌对苯菌灵已产生耐药性[15]。20 世纪80 年代，咪鲜胺继多菌灵后被大量应用，随后其抗药性问题也日益严重[16-17]。2002 年，刘永峰等[18]发现水稻恶苗病菌对咪鲜胺已产生抗药性；2007 年，陈夕军等[19]在田间分离到了8 株抗咪鲜胺的水稻恶苗病菌株；2014 年，郑睿等[20]发现咪鲜胺高抗菌株已成为江苏省水稻恶苗病菌的优势群体。为了有效延缓水稻恶苗病菌的抗药性，多种类型化学药剂 (氰烯菌酯、戊唑醇、咯菌腈等) 和生防菌剂被陆续用于防治水稻恶苗病，刚开始应用时效果显著，很好地控制了病害发生，但由于生产上惯用单一药剂防治病害，田间先后出现了对这些药剂具有不同抗性水平的病原菌群体，因此其抗药性问题依然严峻。

氰烯菌酯自2007 年进入市场，并于2012 年开始登记用作水稻种子处理剂防治水稻恶苗病，该药剂与多菌灵、咪鲜胺等无交互抗性[21]。2016年，侯毅平等[22]首次报道自浙江省绍兴地区分离得到了9 株对氰烯菌酯高抗的水稻恶苗病菌菌株，其中8 株抗药性基因型为myosin5 的第219 位密码子由TCA (丝氨酸) →CCA (脯氨酸) 的突变，另外1 株抗药性基因型为myosin5 的第219 位密码子由TCA (丝氨酸) →TTA (亮氨酸) 的突变；2020 年，张智慧等[23]在江苏省宿迁田间分离到的F.fujikuroi抗性菌株基因型表现为myosin5 第326 位密码子由AGG (精氨酸) →AGT (丝氨酸) 的突变。随着药剂使用年限延长以及使用剂量和使用频率增加，抗药性问题日益严重。因此，研发杀菌剂协同增效组合技术是延缓病原菌抗药性发展、延长药剂使用年限的主要策略。

三唑类杀菌剂具备高效、广谱、内吸性强等特点，具有保护和治疗双重作用，目前已成为满足市场需求且最具有开发潜力的杀菌剂类型之一。但灭菌唑在防治水稻恶苗病方面还未有产品登记，也尚未见其对防治水稻恶苗病是否有效的相关报道。因此，研究灭菌唑对水稻恶苗病菌的抑制效果，能为水稻播种期病害防控提供重要参考。本研究表明，灭菌唑对水稻恶苗病菌具有较好的离体抑制活性，且25 g/L 灭菌唑种子处理悬浮剂 (FS) 对水稻作物安全性良好。

为了进一步降低单一药剂对病原菌群体的选择压力，延缓抗药性产生，本研究测定了氰烯菌酯和灭菌唑按照不同比例复配后对水稻恶苗病菌的联合毒力。结果显示，氰烯菌酯与灭菌唑在供试的7 种复配比例下对水稻恶苗病菌菌丝生长的抑制效果均表现为相加作用，故建议生产中可将灭菌唑与氰烯菌酯轮换或复配使用以协同防控水稻恶苗病，进一步延缓病原菌对单一药剂抗药性的发展，从而保障病害防效和水稻生产安全。