外周血HMGB1水平与不明原因复发性流产患者Th17/Treg平衡的关系

陶晓玲 熊俊 阳艳 方敏 李芸芸

[摘要] 目的 探讨外周血中高迁移率族蛋白B1（HMGB1）水平与不明原因复发性流产患者辅助性T细胞17（Th17）/调节性T（Treg）细胞平衡的关系。 方法 选择2016年1月～2018年1月在湖北省妇幼保健院（以下简称“我院”）进行治疗的不明原因复发性流产患者83例为观察组，选择同期在我院进行产前检查的健康孕妇80名为对照组。入院后采集两组受试者的空腹静脉血，采用流式细胞仪检测其Th17、Treg细胞水平，并进行组间比较。采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测两组受试者的HMGB1、晚期糖基化终产物受体（RAGE）、白细胞介素-6（IL-6）、IL-10、IL-17、转化生长因子-β（TGF-β）水平。并探讨HMGB1与各细胞及细胞因子表达的相关性。 结果 观察组HMGB1、RAGE、Th17、Th17/Treg水平高于对照组，其Treg水平低于对照组，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。观察组IL-6、IL-17水平高于对照组，IL-10、TGF-β水平低于对照组，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。Pearson相关性分析显示，HMGB1与Th17、Th17/Treg、RAGE、IL-6、IL-17水平呈正相关（r = 0.456、0.489、0.528、0.397、0.438，均P < 0.05），与Treg、IL-10、TGF-β水平呈负相关（r = -0.552、-0.523、-0.439，均P < 0.05）。 結论 不明原因复发性流产患者的外周血中HMGB1水平与Th17/Treg平衡间有一定的相关性，HMGB1、Th17、Treg的异常表达及Th17/Treg失衡可能参与了不明原因复发性流产的发生。

[关键词] 高迁移率族蛋白B1;复发性流产;Th17/Treg细胞;相关性

[中图分类号] R714.21          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-7210（2019）02（c）-0094-04

[Abstract] Objective To investigate the relationship between the high mobility group box protein B1 （HMGB1） level in peripheral blood and the helper T cell 17 （Th17）/regulatory T （Treg） cell balance in patients with unexplained recurrent spontaneous abortion. Methods From January 2016 to January 2018， 83 patients with unexplained recurrent abortion who were treated in Hubei Maternal and Child Health Hospital （"our hospital" for short） were selected as the observation group， and 80 healthy pregnant women who underwent prenatal examination in our hospital during the same period were selected as the control group. Fasting venous blood was collected after admission. Th17 and Treg cell levels were measured by flow cytometry and compared between the two groups. The levels of Th17 and Treg cells were detected by flow cytometry and compared between groups. Enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA） was used to detect the levels of HMGB1， advanced glycation end product receptor （RAGE）， interleukin-6 （IL-6）， IL-10， IL-17， and transforming growth factor-β （TGF-β）. The relationship between HMGB1 and the expression of various cells and cytokines was also investigated. Results The levels of HMGB1， RAGE， Th17 and Th17/Treg in the observation group were higher than those in the control group， and the Treg was lower than that in the control group， and the difference was highly statistically significant （P < 0.01）. The levels of IL-6 and IL-17 in the observation group were higher than those in the control group， and the levels of IL-10 and TGF-β were lower than those in the control group， and the difference was highly statistically significant （P < 0.01）. Pearson correlation analysis showed that HMGB1 was positively correlated with Th17， Th17/Treg， RAGE， IL-6， IL-17 levels （r = 0.456， 0.489， 0.528， 0.397， 0.438， P < 0.05）. There was a negative correlation between the levels of HMGB1 and Treg， IL-10 and TGF-β （r = -0.552， -0.523， -0.439， P < 0.05）. Conclusion There is a certain correlation between HMGB1 level and Th17/Treg balance in peripheral blood of patients with unexplained recurrent abortion. The abnormal expression of HMGB1， Th17 and Treg and the imbalance of Th17/Treg may be involved in the occurrence of unexplained recurrent abortion.

[Key words] High mobility group chromosal protein B1; Recurrent spontaneous abortion; Th17/Treg cell; Correlation

复发性流产是指孕妇在妊娠过程中出现连续3次及3次以上次数的自然流产，其发生的原因多数与患者自身的内分泌紊乱、感染因素、遗传因素、生殖器官的解剖学形态异常等有关。而在复发性流产中约有30%～50%患者的发病原因仍不明确，临床上将此类流产称为不明原因复发性流产[1]。随着研究的不断深入，此类不明原因的复发性流产的发生机制的研究取得了一定的进展，主要认为是孕妇在妊娠早期时母体对胎儿产生的免疫反应导致，其中表现最为显著为辅助性T细胞17（Th17）、调节性T细胞（Treg）在母体对胎儿间的相互作用导致免疫耐受、免疫排斥反应的发生，Th17、Treg细胞的水平异常及比例的失衡是主要的病理机制[2-3]。外周血高迁移率族蛋白B1（high mobility group chromosal protein B1，HMGB1）、晚期糖基化终产物受体（advanced glycation end product receptor，RAGE）是一种作用较强的免疫炎性反应因子，可参与机体内一系列炎性反应的发生和进展，并加重机体的炎性反应[4-5]。既往的报道显示[6-7]，HMGB1、RAGE水平在病理性妊娠患者中有显著的变化，提示HMGB1、RAGE可能参与了患者的异常妊娠过程。因此，本研究中通过对不明原因复发性流产妇女的HMGB1、RAGE、Th17、Treg及相关细胞因子的检测分析，探讨HMGB1与Th17/Treg平衡间的关系，以期为不明原因复发性流产的机制研究提供参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2016年1月～2018年1月在湖北省妇幼保健院（以下简称“我院”）进行治疗的不明复发性流产患者83例作为观察组，年龄21～35岁，平均（27.72±5.42）岁，孕龄6～20周，平均（14.33±3.86）周。纳入标准：①经诊断确诊为不明复发性流产，有3次及以上次数的自然流产史;②未发现自然流产的相关病因;③精神状态正常，能够配合研究过程的进行。排除标准：①自然流产有明确的病因;②并发全身恶性肿瘤疾病、自身免疫性疾病等影响本研究各项指标水平的判断。选择同期在我院进行产前检查的健康孕妇80名作为对照组，年龄20～38岁，平均（29.08±5.79）岁，孕龄7～19周，平均（13.76±3.37）周。本研究经医院医学伦理委员会批准，所有受试者均签署知情同意书。

1.2 观察指标及检查方法

统计两组的HMGB1、RAGE、Th17、Treg、Th17/Treg等指标，并比较两组受试者的Th17相关细胞因子IL-6、IL-17和Treg相关细胞因子IL-10、TGF-β水平。

入院后，采集两组受试者空腹静脉血约5 mL，加入到抗凝管中，经Ficoll密度梯度离心机（德国Sigma）离心，分离得到外周血的单细胞，并制备成细胞混悬液，采用Attune NxT流式细胞仪（美国赛默飞世尔科技公司）检测Th17、Treg细胞，并计算Th17/Treg比例。血液样本经TGL-16K高速离心机（上海安亭科学仪器厂）离心分离，得到血清，采用酶联免疫吸附法检测HMGB1、RAGE、白细胞介素-6（IL-6）、IL-10、IL-17、转化生长因子-β（TGF-β），相关检测试剂盒均购自美国R&D公司，操作步骤严格按说明书要求进行。

1.3 统计学方法

采用SPSS 20.0统计学软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验;计数资料用率表示，组间比较采用χ2检验;采用Pearson检验进行相关性分析，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组患者HMGB1、RAGE、Th17、Treg、Th17/Treg水平比较

观察组HMGB1、RAGE、Th17、Th17/Treg水平高于对照组，Treg水平低于对照组，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。见表1。

2.2 两组患者IL-6、IL-17、IL-10、TGF-β水平比较

观察组患者的IL-6、IL-17水平高于对照组，IL-10、TGF-β水平低于对照组，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。见表2。

2.3 HMGB1与各指标相关性分析

Pearson相关性分析显示，HMGB1与Th17、Th17/Treg、RAGE、IL-6、IL-17水平呈正相关（r = 0.456、0.489、0.528、0.397、0.438，均P < 0.05），与Treg、IL-10、TGF-β水平呈负相关（r = -0.552、-0.523、-0.439，均P < 0.05）。

3 讨论

近年来，复发性流产患者呈逐渐增多的趋势，其中有较高比例的患者均为不明原因的自发性流产，严重威胁广大的妊娠期孕妇的生命健康和生活质量，不利于患者正常的妊娠分娩过程的完成。随着发病率的增加，临床对其关注度不断提高，并不断深入探讨其自发流产病因，其中患者自身的免疫学因素与复发性流产病理机制间的关系颇受临床研究者的关注[8-9]。母体与胚胎直接接触的组织部位在临床上被称为母胎界面，正常妊娠的孕妇的母胎界面存在着一定數量的免疫细胞，通常情况下，这些免疫细胞的存在及适宜比例的分布可形成特有的免疫耐受状态，有利于妊娠并保护胎儿正常分娩过程的进行[10]。但是在某些病理因素的影响下，母胎界面的免疫细胞数量和功能发生改变，如各种炎性细胞因子水平的增加，调节并作用于患者自身的固有免疫反应，增加了妊娠期孕妇感染、自身免疫性疾病、排斥反应的发生概率，不利于孕妇妊娠过程中子宫胚胎的发育及营养的供给，增加了孕妇母体对胚胎的免疫排斥反应，从而导致妊娠的失败，出现复发性的流产[11-12]。HMGB1是一种能够参与机体组织细胞的DNA复制、转录、重组及修复过程的DNA伴侣性蛋白。多项研究[13-14]报道证实，HMGB1参与了患者的免疫炎性反应，并且在病理性妊娠患者中检测到HMGB1、RAGE水平的异常表达。在炎性反应的刺激下，HMGB1、RAGE等水平的异常增高表达，使得高浓度的HMGB1、RAGE暴露在母胎界面，从而引起免疫功能的失调，继而导致复发性流产的发生[15]。因此，探讨HMGB1与Th17/Treg平衡间的相关性，可为不明原因复发性流产的治疗提供帮助。

本研究通過比较复发性流产患者和正常妊娠孕妇的各项指标，发现观察组患者的HMGB1、RAGE、Th17、Th17/Treg水平高于对照组，Treg水平低于对照组。在相关细胞因子水平的比较中，观察组患者的IL-6、IL-17水平高于对照组，IL-10、TGF-β水平低于对照组，提示在不明原因复发性流产患者外周血中的HMGB1、RAGE、Th17、Treg、Th17/Treg及相关细胞因子水平IL-6、IL-17、IL-10、TGF-β与正常孕妇相比发生了显著的变化。另外，患者体内的Th17过度表达，会抑制Treg细胞表达，从而使复发性流产孕妇体内出现过度免疫耐受，从而证实了复发性流产的出现与Th17与Treg细胞表达异常及比例的失衡有关[16-17]。复发性流产患者的HMGB1、RAGE水平明显升高，表明此类患者体内出现了炎性反应，导致患者母胎界面的免疫功能的失调。本研究中HMGB1与Th17、Th17/Treg、RAGE、IL-6、IL-17水平呈正相关，与Treg、IL-10、TGF-β水平呈负相关，进一步证明了HMGB1参与了复发性流产患者的Th17/Treg平衡的调节[18-19]。分析其原因，HMGB1通过作用于Th17细胞促进炎性细胞因子的释放，从而使得Th17细胞及相关炎性细胞因子IL-6、IL-17水平随着HMGB1的增加而增加，且呈正相关。HMGB1通过作用于Treg细胞而参与免疫抑制因子的调控，使得Treg及其相关细胞因子IL-10、TGF-β水平随着HMGB1的增加而减少，且呈负相关性。HMGB1通过对患者Th17和Treg两个方面的调节，使患者的Th17/Treg比例平衡被打破[20-21]。HMGB1与RAGE呈正相关，这是因为HMGB1的高表达可诱导RAGE水平的增加，HMGB1可与患者的RAGE受体结合，直接参与机体的免疫炎性反应。

综上所述，不明原因复发性流产患者的外周血HMGB1、RAGE水平会显著升高，Th17细胞、Th17/Treg及相关细胞因子水平IL-6、IL-17水平显著增加，而Treg细胞及相关细胞因子IL-10、TGF-β水平则显著降低。提示HMGB1、Th17、Treg的异常表达及Th17/Treg失衡可能参与了不明原因复发性流产的发生。

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（收稿日期：2018-08-07  本文编辑：王   蕾）