N-乙酰半胱氨酸改善高脂高糖联合缺氧/复氧致H9C2心肌细胞损伤的实验研究

李源 夏中元

[摘要] 目的 探讨抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸（NAC）对高脂高糖联合缺氧/复氧所致H9C2心肌细胞损伤及其对时钟基因BMAL1表达的影响。 方法 将培养的H9C2细胞分为对照组（N组）、高脂高糖联合缺氧/复氧组（HFHG+H/R组）、高脂高糖联合缺氧/复氧+NAC组（HFHG+H/R+NAC组）。CCK-8法检测细胞活性，流式细胞术检测细胞凋亡，DCFH-DA染色观察活性氧（ROS）水平，JC-1染色检测细胞线粒体膜电位（MMP），Western blot测定BMAL1表达水平。 结果 与N组比较，HFHG+H/R组细胞活性明显降低（P < 0.01），凋亡率与ROS水平明显升高（P < 0.01），而BMAL1表达水平显著降低（P < 0.01）。经NAC处理后，HFHG+H/R+NAC组以上变化均显著减小，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。HFHG+H/R组MMP较N组明显降低;经NAC处理后，HFHG+H/R+NAC组MMP明显升高。 结论 NAC可能通过抑制心肌细胞氧化应激水平，并促进时钟基因BMAL1表达，从而减小高脂高糖与缺氧/复氧所导致的心肌细胞损伤。

[关键词] N-乙酰半胱氨酸;BMAL1;氧化应激;心肌细胞

[中图分类号] R587.1          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-7210（2019）02（c）-0004-04

[Abstract] Objective To investigate the effect of antioxidant N-acetylcysteine （NAC） on H9C2 cardiomyocyte injury induced by high-fat and high-glucose combined with hypoxia/reoxygenation and its effect on the expression of clock gene BMAL1. Methods H9C2 cells were divided into control group （N group）， high-fat and high-glucose combined with hypoxia/reoxygenation group （HFHG+H/R group）， high-fat and high-glucose combined with hypoxia/reoxygenation +NAC group （HFHG+H/R+NAC group）. Cell viability was detected by CCK-8 method， cell apoptosis was detected by the flow cytometry， reactive oxygen species （ROS） level was observed by DCFH-DA staining， mitochondrial membrane potential （MMP） was detected by JC-1 staining， and the expression level of BMAL1 was determined by Western blot. Results Compared with N group， the cell viability of HFHG+H/R group was significantly lower （P < 0.01）， the apoptosis rate and ROS level were significantly increased （P < 0.01）， while the expression level of BMAL1 was significantly reduced （P < 0.01）. After NAC treatment， the changes of indicators above in the HFHG+H/R+NAC group were significantly reduced， the differences were highly statistically significant （P < 0.01）. MMP in the HFHG+H/R group was significantly lower than that in the N group. After NAC treatment， MMP of HFHG+H/R+NAC group was significantly increased. Conclusion NAC may reduce the oxidative stress level of cardiomyocytes and promote the expression level of clock gene BMAL1， thereby reducing cardiomyocyte damage induced by high-fat and high-glucose combined with hypoxia/reoxygenation.

[Key words] N-acetylcysteine; BMAL1; Oxidative stress; Cardiomyocyte

缺血性心臟病（ischemic heart disease，IHD）是2型糖尿病（T2DM）患者的主要死亡原因。改善缺血心肌的血液灌注是治疗IHD最根本的措施，但缺血再灌注会导致缺血心肌损伤的进一步加重[1]。研究表明，氧化应激是糖尿病并发症IHD缺血再灌注损伤的主要机制[2-3]。近年研究发现节律紊乱是增加糖尿病、肥胖和代谢综合征风险的一个重要因素，并可能是导致心血管事件发生的重要机制[4]。进一步研究发现，胰岛素分泌具有特殊节律，并与时钟基因BMAL1密切相关[5]。不仅如此，BMAL1亦有调控氧化应激的作用[6]。因此，本研究旨在明确体外条件下抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸（N-acetylcysteine，NAC）对高脂高糖复合缺氧/复氧所致H9C2细胞损伤的保护作用，并探索其对时钟基因BMAL1表达的影响。现报道如下：

1 材料与方法

1.1 细胞及试剂

H9C2大鼠胚胎心肌细胞购自武汉大学细胞典藏中心。活性氧（ROS）試剂盒（批号：170824）、JC-1试剂盒（批号：170904）、Cell Counting Kit-8（CCK-8）（批号：170716）均购自中国碧云天公司;PE/7-AAD试剂盒（批号：7026588）购自美国BD公司;BMAL1抗体购自美国Novus公司;β-actin抗体购自美国Cell Signaling Technology（CST）公司;羊抗兔二抗购自美国Li-cor公司;NAC试剂购自美国sigma公司;荧光显微镜来自奥林巴斯公司。

1.2 方法

1.2.1 H9C2大鼠心肌细胞的培养  使用含10%胎牛血清的DMEM培养基培养H9C2细胞。实验前去血清培养24 h，使细胞同步化，然后对心肌细胞分别进行如下处理：对照组（N组）培养基中含5.5 mmol/L葡萄糖、20 mmol/L甘露醇，高脂高糖复合缺氧/复氧组（HFHG+H/R组）培养基中含25 mmol/L葡萄糖、500 μmol/L软脂酸，高脂高糖复合缺氧/复氧+NAC组（HFHG+H/R+NAC组）培养基中含25 mmol/L葡萄糖、500 μmol/L软脂酸、400 μmol/L NAC。

1.2.2 CCK-8法检测细胞活性  取对数生长期的H9C2细胞，计数后种植于96孔板，每孔种植细胞数为10 000个，每个处理组设3个复孔。37℃、5%CO2、饱和湿度条件下培养24～72 h。每孔加入10 μL CCK-8溶液于酶标仪检测。置于酶标仪中在450 nm处检测吸光度值（OD值），以“培养液空白对照孔”调零。细胞存活率（%）=处理组A/对照组A×100%。

1.2.3 JC-1法检测线粒体膜电位（mitochondrial membrane potential，MMP）  处理各组细胞后，用PBS洗涤1次，加入DMEM 1 mL，再加入1 mL JC-1染色工作液并混匀。在37℃培养箱中孵育20 min。孵育同时，按1∶4比例混匀染色缓冲液（5×）和蒸馏水，配制成染色缓冲液（1×），置于冰上。孵育完成后，用配好的JC-1染色缓冲液（1×）将细胞洗2次。再加入2 mL DMEM后置于荧光显微镜下，观察并记录各组细胞的荧光强度。

1.2.4 Western blot检测BMAL1表达水平  收集处理各组细胞，经RIPA裂解，超声破碎，12 000 g 4℃离心，取上清。用BCA法测定蛋白样品浓度，用RIPA校正。按体积比4∶1加入5×上样缓冲液，100℃金属浴5～10 min。按50 μg/泳道行SDS-PAGE凝胶电泳，于100 V恒压下电泳90 min，200 mA恒流转膜90 min，5%脱脂牛奶封闭1 h，使用兔抗鼠抗体抗（1∶1000）4℃孵育过夜，TBST洗膜5 min×3次，荧光二抗室温孵育1 h，TBST洗膜5 min×3次，最后，用Odyssey荧光红外成像系统进行扫膜分析并读取各组灰度值。

1.2.5 DCFH-DA染色检测ROS水平  去除培养板中培养液，更换含有DCFH-DA（终浓度为10 μmol/L）的DMEM培养基。37℃培养箱中孵育20 min。用无血清DMEM洗涤3次，于荧光显微镜下观察各组细胞荧光强度。

1.2.6 流式细胞术检测细胞凋亡  收集处理后各组细胞，计数1×107个细胞，离心去上清，PBS洗涤2次，离心去上清，加入100 μL结合缓冲液重悬，加入5 μL 7-AAD、5 μL PE溶液混匀，避光孵育20～30 min，再加入400 μL缓冲液混匀，流式细胞仪分析凋亡率。

1.3 统计学方法

采用GraphPad Prism 6.0软件进行统计学分析。计量资料以均数±标准差（x±s）表示。本研究数据均符合正态分布。多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用LSD-t检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同时间点三组细胞活力比较

在培养24、48、72 h时，三组细胞活力总体比较，差异有高度统计学意义（P < 0.01）;与N组比较，HFHG+H/R组细胞活性明显下降（P < 0.01），加入NAC后细胞活力较HFHG+H/R组明显提高（P < 0.01）。

2.2 三组细胞ROS水平比较

三组ROS水平比较，差异有统计学意义（F = 383.9，P < 0.01）;与N组（0.019±0.003）比较，HFHG+H/R组ROS（0.099±0.003）生成明显增多（P < 0.01）;与HFHG+H/R组比较，HFHG+H/R+NAC组ROS（0.016±0.002）生成明显减少（P < 0.01）。

2.3 三组细胞MMP比较

与N组比较，HFHG+H/R组MMP明显降低;与HFHG+H/R组比较，HFHG+H/R+NAC组MMP明显升高。

2.4 三组细胞凋亡率比较

三组细胞凋亡率比较，差异有高度统计学意义（F = 1746.0，P < 0.01）。与N组[（0.912±0.015）%]比较，HFHG+H/R组细胞凋亡率[（16.601±0.304）%]明显升高（P < 0.01）;与HFHG+H/R组比较，HFHG+H/R+NAC组细胞凋亡率[（8.055±0.115）%]明显降低（P < 0.01）。

2.5 三组细胞BMAL1蛋白表达水平比较

三组BMAL1蛋白表达水平比较，差异有高度统计学意义（F = 1867.0，P < 0.01）。与N组比较，HFHG+H/R组BMAL1表达明显降低（P < 0.01）;与HFHG+H/R组比较，HFHG+H/R+NAC组BMAL1表达明显升高（P < 0.01）。

3 讨论

T2DM可通过持续性高血糖症、高脂血症、增加的ROS产生和炎症通路下游转录因子，影响心肌糖/脂代谢、肌细胞生长、内皮功能和心肌结构的改变等诱导糖尿病心肌病[7]。而心肌组织中过度产生的ROS被认为是糖尿病心肌病发展的最主要机制之一[8]。心肌在高糖高脂的外环境下，氧化应激与脂质过载增加，可能是ROS产生的主要原因[9]。心肌细胞中ROS主要来源于NADPH和线粒体[10]。NAC可直接透过细胞膜及线粒体膜而直接清除ROS。

T2DM主要发病机制是胰岛素抵抗，血脂代谢异常可加重胰岛素抵抗[11]。长期高脂高糖刺激亦可对心肌细胞产生损伤[12]。研究表示高脂高糖可造成乳鼠心肌细胞损伤[13]。本研究选择H9C2心肌细胞进行实验，对各组细胞分别培养24、48、72 h后进行处理，再使用CCK-8实验检测细胞活力。各时间点细胞中，HFHG+H/R组细胞活性与N组比较均出现明显下降（P < 0.01），加入NAC后细胞活力均有明显提高（P < 0.01），提示NAC可改善高脂高糖与缺氧/复氧加重的H9C2心肌细胞损伤。因为培养24 h各组即可出现明显差异，且差異有统计学意义，因此，培养时间我们选择24 h。

随后，我们通过荧光显微镜观察细胞的ROS水平，与HFHG+H/R组比较，加入NAC后细胞ROS表达明显降低，差异有高度统计学意义（P < 0.01），提示NAC可减轻高脂高糖复合缺氧/复氧导致的ROS上升。

细胞损伤的最终表现就是细胞死亡，细胞死亡主要方式为坏死和凋亡[14]。MMP水平下降是细胞凋亡早期的一个标志性事件[15]。JC-1荧光探针可检测MMP水平。荧光显微镜观察显示，与N组比较，HFHG+H/R组红色荧光明显降低，加入NAC后，HFHG+H/R+NAC组红色荧光明显升高;流式细胞仪凋亡检测结果与JC-1结果一致。提示高脂高糖复合缺氧/复氧可使H9C2心肌细胞凋亡加重，而NAC可减轻这一促进作用。

研究表明核心时钟基因BMAL1靶向缺失的小鼠（BMAL1-/-）显示了不同器官的高水平的ROS[16]，还有研究表明，BMAL1缺失的小鼠ROS产生增加[17]，表明BMAL1在氧化还原稳态中产生了作用。

昼夜节律紊乱可影响糖脂代谢，亦可促进T2DM的发展[18-19]。BMAL1的表达与胰岛生长、存活和增殖调节有关，通过药物影响细胞中BMAL1的表达可改善胰岛损伤[20]。本研究中，与HFHG+H/R组比较，HFHG+H/R+NAC组BMAL1的表达明显升高（P < 0.01），提示NAC可影响高脂高糖复合缺氧/复氧处理的H9C2心肌细胞BMAL1的表达水平。

综上所述，NAC可能通过抑制心肌细胞氧化应激水平，并促进时钟基因BMAL1表达水平，从而减小高脂高糖复合缺氧/复氧所导致的心肌细胞损伤。

本研究主要在细胞上进行了实验和论证，在动物模型上尚未验证，具有一定局限性，后期将进一步对糖尿病大鼠进行实验研究。本研究通过使用缺氧/复氧模拟缺血再灌注并用ROS抑制剂NAC作用于高脂高糖培养的H9C2心肌细胞，通过对BMAL1表达、细胞活性、MMP、凋亡率和ROS水平的检测，得出结论：NAC可能通过抑制心肌细胞氧化应激水平，并促进时钟基因BMAL1表达水平，从而减小高脂高糖复合缺氧/复氧所导致的心肌细胞损伤。

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（收稿日期：2018-08-14  本文编辑：罗乔荔）