基于网络药理学的补阳还五汤防治阿尔茨海默病的机制研究

汪白云 刘国良 朴成玉 陈巧云 陈景华 薛慧 刘斌

[摘要] 目的 预测发现补阳还五汤防治阿尔茨海默病（AD）的作用靶标，探讨多成分-多靶点-多通路的协同作用机制。 方法 基于网络药理学方法针对补阳还五汤的方剂组成，采用多元网络药理学方法预测补阳还五汤的体内作用靶标，通过BATMAN-TCM等数据库对比补阳还五汤抗AD药物靶标，最终采用Cytoscape软件构建补阳还五汤成分-靶点-通路的网络。 结果 补阳还五汤中活性成分涉及多个与AD直接相关的体内靶标，如载脂蛋白E（APOE）等。同时涉及多个代谢通路，如甘油磷脂代谢、胆碱能突触、胆固醇代谢、AD通路等。 结论 补阳还五汤主要通过多成分协同起效，如1-十六碳烯对载脂蛋白E调节间接起到调控疏水性淀粉样β（Aβ）沉淀形成、藏花醛对乙酰胆碱酯酶和丁酰胆碱酯酶的抑制作用等，进而延缓AD的发生发展。

[关键词] 网络药理学;补阳还五汤;阿尔茨海默病;靶点;载脂蛋白E

[中图分类号] R749          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-7210（2019）02（c）-0012-04

[Abstract] Objective To predict and discover the target of Buyang Huanwu Decoction in the prevention and treatment of Alzheimer′s disease （AD） and explore the synergistic mechanism of multi-component， multi-target and multi-pathway. Methods According to the composition of Buyang Huanwu Decoction， the in vivo target of Buyang Huanwu Decoction was predicted by multiple network pharmacology methods. The target of anti-AD drug was selected by BATMAN-TCM and other databases. Finally， the components of Buyang Huanwu Decoction were constructed by Cycaptose software for target path network. Results The active components of Buyang Huanwu Decoction were involved in many targets directly related to Alzheimer′s disease， such as apolipoprotein E （APOE）. At the same time， it involves many metabolic pathways， such as glycerol phospholipid metabolism， cholinergic synapses， cholesterol metabolism， Alzheimer′s disease pathway and so on. Conclusion Buyang Huanwu Decoction mainly works through multi-component synergy， such as 1-hexadecence regulates apoliporotein E indirectly to regulate the formation of hydrophobic amyloid β （Aβ）， the inhibition of safranal on acetylcholinesterase and butyrocholinesterase， thus delaying the occurrence and development of AD.

[Key words] Network pharmacology; Buyang Huanwu Decoction; Alzheimer′s disease; Target; Apolipoprotein E

阿爾茨海默病（AD）是一种极大影响患者、家庭的重大社会问题[1-6]。常规的临床诊断大多采用通过咨询患者病史和认知能力测试，但这些方法具有较低的敏感性和特异性，并只有在患者死亡后通过解剖发现疾病过程的物理证据时，才有可能作出明确的诊断。然而，当患者的体征和症状可以明确诊断时，其脑病理学往往相当严重，这极大地影响和延误了患者的病情及康复。目前，针对AD的治疗药物很多，但大多有明显的毒副作用，如现阶段唯一获准用于AD主要治疗药物的乙酰胆碱酯酶抑制剂（ACHEⅠ），不适用于心动过缓及低血压患者。因此，治疗AD的有效和副作用小的药物亟待发现。

中医理论认为，气为血之帅，血为气之母，治风先治血，血行风自灭。气虚血瘀是缺血性脑血管病发生的主要病机，外感邪气或脏腑功能失调，气血运巧不畅。血不达于脑，正气亏虚，气虚推动无力，产生血疲，两者互为因果，病情缠绵难愈。益气活血的代表方剂补阳还五汤在临床作为防治缺血性中风重要药物，一直被广泛应用。但明确的基于补阳还五汤治疗缺血性中风的体内作用靶标及机制尚不可知，本实验采用网络药理学方法，从方剂所含成分入手，根据药物分子的理论对接靶标预测补阳还五汤的直接作用成分，为实验研究和临床用药提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

TCMID中药系统药理学技术平台（http：//www.megabionet.org/tcmid/）;BATMAN-TCM平台（http：//bionet.ncpsb.org/batman-tcm/）;ChemBioOffice 2014综合性科学应用软件包（CambridgeSoft公司，美国），PharmMapper反向药效团匹配数据库（http：//lilab.ecust.edu.cn/pharmmapper/index.php）;STRING 10.5功能蛋白的关联网络数据库（https：//string-db.org/）;UniProt蛋白质生物功能数据库（http：//www.Uniprot.org/）;Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes京都基因与基因组百科全书（http：//www.Genome.jp/kegg/）;DAVID数据库（https：//david.ncifcrf.gov/）;MAS 3.0生物分子功能注释系统（http：//mas.capitalbiotech.com/mas3/）;Cytoscape 3.5.1数据可视化软件（http：//cytoscape.org/）。

1.2 方法

1.2.1 构建补阳还五汤化学成分数据库  通过TCMID数据库和美国国家医学图书馆PubMed数据库检索补阳还五汤中所含化学成分[7-13]，特别是口服补阳还五汤后入血成分[14]，构建补阳还五汤所含化学成分数据库。

1.2.2 靶点预测及筛选  基于补阳还五汤的化学成分，BATMAN-TCM数据平台对补阳还五汤所含化学成分进行化合物-作用靶标预测，并设定阈值收录分子对接打分最高的前10个靶点用于下一步靶点及药物作用网络分析;将补阳还五汤中所含的143个化学成分全部带入ChemBioOffice 2014软件，用于生成具有化学物3D结构的mol2文件，并将其分别带入PharmMapper反向药效团匹配数据库，根据空间结构预测与其对接不同程度的作用靶点;同时将上述143个化合物带入STRING 10.5功能蛋白的关联网络数据库预测药物靶点。最后将上述结果进行汇总全部输入蛋白质生物功能数据库（UniProt），将其校正为官方名称。

1.2.3 通路获取及生物机制分析  将获取的所有靶点编号带入MAS 3.0数据库，通过对基因、mRNA、蛋白、通路、协同调节基因、疾病、相互作用、miRNA等多方面综合分析，最终获取关于补阳还五汤关于作用靶点的整合数据。

1.2.4 网络构建及补阳还五汤防治AD的作用机制分析  将上述初筛靶标带入DAVID数据库进行功能和通路富集，选择P < 0.05，且与AD相关的基因本体术语（Gene ontology term）、KEGG通路（KEGG pathway）、孟德尔人类遗传/治疗靶数据库（OMIM/TTD disease）。富集并聚焦核心通路及靶点。最终通过Cytoscape 3.5.1软件的Network Analyzer插件分析及构建靶点的代谢网络。

2 结果

2.1 补阳还五汤所含化学成分结果

通过TCMSP及BATMAN-TCM数据平台及文献检索整合获取补阳还五汤中160个化合物，其中与预防AD密切相关的成分有16个，分别是香芹酚、1-十六碳烯、乙酸亚油醇、藏花醛、新辛烯、3-己醇、甜菜碱、苯乙醛、3，5-二甲氧基二苯乙烯、胆碱、1-十七碳烯、2-己醇、丹皮酚、花生酸、乙酸、刀豆氨酸。与AD发生发展密切相关的主要靶标有10个，分别是载脂蛋白E、乙酰胆碱酯酶、丁酰胆碱酯酶、缓激肽B2、羧酸酯酶1、烟碱型乙酰胆碱受体B2、内皮素转换酶1、犬尿氨酸酶、神经生长因子受体、前列素内环氧化物合成酶2。见表1。

2.2 补阳还五汤潜在靶点代谢通路结果

整合上述数据处理过程及相关数据库检索结果，汇总补阳还五汤代谢通路结果。见表2。

2.3 网络构建和分析

最后利用Cytoscape 3.5.1软件进行处理，得到补阳还五汤“结构类型-化合物-蛋白靶点-通路-病理过程”的成分靶标互作图。补阳还五汤中含有的1-十六碳烯、1-十七碳烯和新辛烯。

3 讨论

通过对网络中各化合物作用通路具体信息分析发现载脂蛋白E（ApoE）与AD的发病机制有密切相关性[15-20]。ApoE是一种血浆蛋白，由229个氨基酸组成，与脂肪结合及胆固醇类物质的转运相关。其主要的合成和分泌场所是肝脏，其次是大脑。现代研究表明ApoE直接促进了疏水性淀粉样β（Aβ）沉淀的形成。可以通过加入纯化后的ApoE来控制Aβ发生聚集的相对速度和聚集程度。ApoE多态性等位基因是AD风险的主要遗传决定因素：携带ε4等位基因的个体与携带较常见ε3等位基因的个体比较，患AD的风险增加，而ε2等位基因则降低风险。ApoE ε4等位基因的存在还与正常老化期间脑淀粉樣血管病的风险增加和与年龄相关的认知能力下降有关。载脂蛋白与多种细胞表面受体结合，传递脂质，还与Aβ肽结合，引发毒性事件，导致AD的突触功能障碍和神经变性。在大脑中，载脂蛋白在调节脑脂质转运、葡萄糖代谢、神经元信号传导、神经炎症和线粒体功能方面具有明显的功能。神经退行性疾病AD的特征是存在β-淀粉样蛋白（Aβ）病理和Tau病理。罕见的AD病例由常染色体显性突变引起，但大多数患者有散发性AD。导致散发性AD的途径可能是多种多样的，并且根据患者是否携带载脂蛋白，疾病途径可能不同。叶黄素ApoE ε4是AD的主要遗传风险因子，并且可能促进Aβ的积累，触发导致Tau病理学扩散、突触功能障碍、萎缩和认知能力下降的级联反应。30%～40%的散发性AD痴呆患者是ApoE ε4阴性，这些患者可能主要有非遗忘性认知障碍等现象，与ApoE ε4阳性AD患者比较，以往对AD中ApoE ε4的研究由于缺乏对AD诊断的Aβ-生物标志物确认而受到限制，这使得患者有可能被纳入AD的假阳性诊断研究中。目前，关于ApoE ε4在前驱性AD中的作用研究较少，无论在临床实践中还是在药物开发中，前驱性AD都是一个日益重要的疾病阶段。因此如何靶向性的针对ApoE来设计是治疗AD的有效策略。

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（收稿日期：2018-10-06  本文编辑：封   华）