毕赤酵母甘露寡糖对大肠杆菌攻毒断奶仔猪免疫细胞数量的影响

■李玉欣 王海彦 韩 博

（1.中国农业大学动物医学院，北京 100193；2.北京华美源生物科技有限公司，北京 101199）

断奶是仔猪生长发育过程中继出生后的第二个关键时期，由于营养、环境和心理因素的作用，导致仔猪极易受到病原微生物的侵害而感染大肠杆菌病、气喘病和沙门氏菌病等[1]，其中致病性大肠杆菌是导致仔猪断奶腹泻和死亡的一个主要原因[2]，肠道黏膜免疫是近些年才发展起来的一个独特的研究领域，动物正常生理状态时，肠道免疫系统与大量抗原接触，肠黏膜既要对食源性抗原产生正确的免疫应答反应，保障机体对营养物质进行消化吸收，又要产生免疫防御功能，抵抗外来抗原物质的入侵，小肠上皮细胞间的淋巴细胞、杯状细胞和肥大细胞等免疫细胞数量的变化可以反映肠道的局部免疫状况[3]。本试验使用大肠杆菌攻毒模拟现实生产中仔猪腹泻及肠道损伤条件下，研究毕赤酵母甘露寡糖对断奶仔猪生产性能、肠上皮细胞内免疫细胞数量变化与分布的影响，探讨毕赤酵母甘露寡糖的作用机理。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本试验所使用的毕赤酵母甘露寡糖标识含量为：甘露糖≥15%、甘露寡糖≥20%、蛋白质≥25%，水分≤6%和粗灰分≤2%。

1.2 试验动物分组与日粮

本试验选用48头平均体重为7.34 kg的健康断奶仔猪，共饲养24 d。试验初期分为两个日粮处理组：对照组和0.2%毕赤酵母甘露寡糖组，对照组饲喂基础日粮，试验组在基础日粮中额外添加0.2%毕赤酵母甘露寡糖，每个处理组设12个重复，每个重复2头仔猪，所有饲粮均为干粉料（基础日粮组成及营养水平见表1）。

表1 断奶仔猪试验基础日粮的组成及营养水平

1.3 试验动物管理

试验在北京市海淀区苏家坨乡苏三四种猪场进行。该场保育舍为全封闭式猪舍，屋顶排气扇通风，舍内温度、通风强度和湿度均为自动化系统控制，试验猪只采取单笼饲养方式区分，猪舍内温度变化控制在（28.0±2.5）℃，干粉料饲喂，自由采食和饮水。猪舍内漏缝金属地板，不锈钢可调式料槽，乳头式饮水器。按猪场常规管理程序和免疫程序进行饲喂和免疫接种。

1.4 大肠杆菌攻毒液体制备

本试验攻毒所用2株大肠杆菌均为致病性大肠杆菌非模式菌株，其血清型分别为O64∶K99（C83709）、O138∶K88（C83905）。每种菌株接种在营养肉汤培养液中，经过37℃恒温摇床培养12 h后离心收集菌体，并用PBS缓冲液洗涤、复溶到PBS缓冲液中调整到攻毒浓度，在试验进行到第14 d时，对照组、毕赤酵母甘露寡糖组的1/2仔猪每天每头灌服30 ml浓度为1010CFU/ml（2个菌株按50∶50混合）的大肠杆菌培养液，另1/2的对照组和酵母甘露寡糖组的仔猪灌服相同剂量的PBS无菌培养液作为大肠杆菌攻毒的对照，直至灌服大肠杆菌攻毒组出现腹泻症状为止。

1.5 检测指标

试验开始和结束时逐个称量每头试验仔猪的空腹体重，计算试验期间的平均日增重；每天9：00和17：00观察仔猪排粪情况并评分（见表2），腹泻指数=粪便分数之和/试验仔猪头数；于试验结束时收集料槽中的剩余饲料，计算试验期间的平均日采食量；根据平均日增重和平均日采食量计算饲料效率。于试验第24 d，将各试验组所有猪只提前12 h停食空腹待宰，处死后分别取十二指肠、空肠和回肠中段测定上皮间淋巴细胞、杯状细胞和肥大细胞数量。

表2 仔猪腹泻指数评分

1.6 数据处理与统计分析

数据采用SPSS19.0统计软件中的One-Way ANO⁃VA进行统计处理，比较各个处理间的差异性用Dun⁃can's方法进行多重比较，P＜0.05时确定为有显著差异。

2 试验结果与分析

2.1 毕赤酵母甘露寡糖对大肠杆菌攻毒后断奶仔猪生长性能的影响（见表3）

表3 日粮中添加毕赤酵母甘露寡糖对大肠杆菌攻毒后断奶仔猪生长性能的影响

大肠杆菌攻毒的试验组的末重和平均日增重明显优于对照组（P＜0.05）。大肠杆菌攻毒组15～21 d仔猪的腹泻指数显著高于不攻毒组（P＜0.05），试验组的腹泻指数低于对照组。大肠杆菌攻毒明显降低了对照组试验末重和平均日增重（P＜0.05）。日粮中添加0.2%毕赤酵母甘露寡糖能够改善大肠杆菌攻毒对仔猪造成的试验末体重和平均日增重的负面影响。

2.2 毕赤酵母甘露寡糖对大肠杆菌攻毒后断奶仔猪肠道黏膜免疫细胞数量的影响（见表4）

由表4可知，大肠杆菌不攻毒情况下，毕赤酵母甘露寡糖可以提高断奶仔猪肠黏膜上皮间淋巴细胞的数量，毕赤酵母甘露寡糖(试验组)还有降低各段仔猪肠道黏膜肥大细胞数量的趋势，但差异均不显著（P＞0.05）。

大肠杆菌攻毒可以显著提高回肠黏膜上皮细胞间淋巴细胞的数量（P＜0.05），大肠杆菌攻毒也可以显著提高十二指肠杯状细胞数量（P＜0.05），大肠杆菌攻毒有降低对照组各段肠道黏膜内肥大细胞数量的趋势，但差异不显著（P＞0.05）。

表4 毕赤酵母甘露寡糖对断奶仔猪十二指肠、空肠和回肠免疫细胞细胞数量的影响

与大肠杆菌不攻毒相比，给断奶仔猪补充毕赤酵母甘露寡糖可以减缓大肠杆菌攻毒导致的空肠黏膜上皮细胞间淋巴细胞和杯状细胞数量升高的趋势，但对照组和试验组间差异不显著（P＞0.05）。毕赤酵母甘露寡糖显著降低了大肠杆菌攻毒组回肠杯状细胞的数量（P＜0.05）。毕赤酵母甘露寡糖对大肠杆菌攻毒导致十二指肠和空肠肥大细胞降低有减缓作用，但各组间差异均不显著（P＞0.05）。

3 讨论与分析

3.1 毕赤酵母甘露寡糖对大肠杆菌攻毒后生长性能的影响

本试验在试验后期对一半的仔猪进行致病性大肠杆菌攻毒，并且导致攻毒仔猪出现黄色软粪腹泻症状，降低了平均日采食量和后期的增重速度，因此对照组攻毒仔猪出现了饲料效率下降的现象。试验15～21 d试验组仔猪攻毒后的腹泻指数低于攻毒对照组，而且平均日采食量和饲料效率没有下降，说明毕赤酵母甘露寡糖能够提高断奶仔猪对大肠杆菌攻毒的抵抗力，因而提高生长性能。

3.2 肠道黏膜免疫细胞数量的影响

正常健康生理状况下，上皮淋巴细胞处于相对稳定的水平，当受到外界病原菌或断奶等刺激时，淋巴细胞从血液向肠道上皮中迁移[4]，起到修复肠黏膜损伤和清除病原菌等作用。这是本试验在大肠杆菌攻毒后上皮淋巴细胞数量表现为显著增加的主要原因。杯状细胞是一种典型的糖蛋白分泌细胞，其分泌的黏蛋白释放到肠腔后变成润滑性黏液分布于上皮表面，起到保护肠黏膜的作用。本试验用大肠杆菌攻毒后，与不攻毒相比，十二指肠和空肠对照组中的杯状细胞表现增加明显，是机体肠道黏膜局部细胞免疫增强的表现形式之一。

在应激状态下，一些细胞因子诱导肥大细胞通过脱颗粒反应释放组胺、白三烯等炎性介质和细胞因子IL-1、IL-6、INF-γ等[5]，这些介质和细胞因子作用于组织细胞和趋化细胞，并诱导这些细胞大量分泌炎症因子[6]，放大炎症反应过程，影响肠道屏障功能[7]。本试验结果表明在大肠杆菌不攻菌情况下，毕赤酵母甘露寡糖可引起小肠黏膜上皮内淋巴细胞和杯状细胞数量增加，肥大细胞数量降低，说明酵母甘露寡糖可以提高肠黏膜细胞的免疫力，对外源病原菌起免疫监视作用。

4 结论

试验表明毕赤酵母甘露寡糖能够改善大肠杆菌攻毒对仔猪造成生长速度和饲料效率的负面影响；毕赤酵母甘露寡糖能增加上皮细胞间淋巴细胞和杯状细胞数量，说明毕赤酵母甘露寡糖可以提高肠黏膜细胞的免疫反应。