枯草芽孢杆菌B6的特性及其对哺乳期母猪生产性能的影响

■郑宏臣 甄 杰 郑 雯 谭 明 徐健勇 宋 诙

（中国科学院天津工业生物技术研究所工业酶国家工程实验室天津工业生物系统与过程重点实验室，天津 300308）

枯草芽孢杆菌是目前畜牧养殖业中应用较为广泛的益生菌[1]。枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)属于革兰氏阳性、好氧型杆状细菌，是公认安全(Generally Recognized As Safe，GRAS)菌株[2]。该菌种在自然界中分布广泛，其产生的次生代谢产物种类多，抑菌活性强、抑菌谱广，同时具有激活免疫、促生长等功能特性，显示了很好的饲用益生菌的应用潜力[3-4]。

微生物来源的胞外多糖具有抗肿瘤、抗糖尿病、降血脂、提高免疫力等多种生物学功能[5-7]，如来源于解淀粉芽孢杆菌的胞外多糖能够抑制胃癌细胞MC-4和SGC-7901生长活性[8]；来源于解淀粉芽孢杆菌LPL061的多糖具有免疫调节作用，其发酵产率为4.46 g/l[9]；Cellulomonas sp.GJT07 发酵优化后果聚糖产量为15 g/l[10]。

本文以一株高产功能性果聚糖的枯草芽孢杆菌为研究对象，对菌株发酵产果聚糖的发酵条件、果聚糖的功能活性，以及该菌株的应用特性及其对孕期母猪的饲喂效果进行了系统研究，为开发一株具有独特性能的新型益生菌剂奠定了良好的理论基础。

1 材料与方法

1.1 菌种及发酵培养基

枯草芽孢杆菌B6（Bacillus subtilisB6）菌株由本实验室筛选保存。

发酵培养基成分：400 g/l蔗糖、25 g/l可溶性淀粉、5 g/l酵母浸粉、磷酸氢二钾 1 g/l、氯化钠10 g/l、氯化钙0.3 g/l、硫酸锌0.01 g/l、硫酸亚铁0.03 g/l、硫酸锰0.1 g/l和硫酸镁1 g/l。

1.2 液体发酵

①一级种子液制备：取甘油管中保存的菌液按照2‰的接种量接种于20 ml LB培养基中，37℃、220 r/min震荡培养10～12 h。

②二级种子液制备：将一级种子液按照2%的接种量接种于200 ml LB培养基中，37℃、200 r/min震荡培养10～12 h。

③三级种子液制备：将二级种子液接种至5 L发酵培养基中37℃、pH值7.0培养至DO上升。

④100 L种子液制备：将三级种子液接种至100 L发酵培养基中37℃、pH值7.0培养。罐压0.05 MPa，通气150～300 L/m，初始转速150 r/min。设定转速串联溶氧（40%），最高转速450 r/min。培养至溶氧开始上升，pH值偏碱时，进行移种。

⑤ 1 000 L罐发酵：配制300 L（灭菌后400 L）发酵培养基115℃灭菌。将100 L种子液移种至1 000 L发酵罐中，恒温37℃、pH值7.0，初始通气800 L/m（最大为1 500 L/m），初始转速150 r/min（最大转速为350 r/min）。设定转速串联溶氧（30%）。

⑥计数与检测：在发酵过程中每隔6 h取一份菌液样品，检测OD600数值，以10为梯度分别稀释至一定倍数后进行平板涂布，放入37℃温箱培养9 h后计数。一份直接涂布，另一份80℃水浴10 min以后再涂布。

1.3 抗氧化能力测定

① ABTS自由基清除能力测试：100 μl样品溶液与3 000 μl由磷酸盐缓冲液(10 mmol/l，pH值7.4)稀释的ABTS自由基溶液(其在734 nm处吸光值为0.70±0.02)快速混匀后，避光反应6 min，测定反应液在734 nm处的吸光度。按照公式（1）计算ABTS自由基清除率。

式中：Ablank——空白样品吸光度；

Asample——测试样品吸光度。

解淀粉芽孢杆菌果聚糖测试浓度为25 mg/ml。

②DPPH自由基清除能力测试：1 ml样品溶液、1 ml由无水乙醇配制0.2 mmol/l的DPPH溶液和1 ml二次水快速混匀后，避光反应30 min，测定反应液在517 nm处的吸光值。按照公式(2)计算DPPH自由基清除率。

式中：Ablank——空白样品吸光度；

Asample——测试样品吸光度。

③铁还原能力测试：取100 μl样品溶液与3 ml铁还原(FRAP)试剂混匀后于37℃水浴中反应5 min，测定593 nm处吸光值。同时取浓度0～1.0 mmol/l的FeSO4溶液各100 μl代替样品反应，以593 nm处吸光值为纵坐标，FeSO4浓度为横坐标，制作标准曲线。通过标准曲线计算样品对应的FeSO4浓度，表示铁还原能力。

1.4 孕期母猪饲喂实验

选择胎次接近、健康状况良好的长白哺乳母猪48头，平均分成两组，每组24头，实验从产仔前30 d至哺乳仔猪22日龄断奶结束，对照组为基础日粮，益生组每日添加1 mlB.subtilisB6液体菌剂。

2 结果与讨论

2.1 枯草芽孢杆菌B6液体发酵高产果聚糖

前期研究发现枯草芽孢杆菌B6发酵过程中可产生具有良好生物活性的功能多糖，并鉴定其主要成分为果聚糖。本文通过实验进一步了解不同碳源对枯草芽孢杆菌发酵产功能性低碳的影响，分别以400 g/l的葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、半乳糖、果糖为发酵培养基的碳源，其他成分不变。以2%的接种量于 37℃、200 r/min条件下培养 24 h，结果如表1所示，B.subtilisB6发酵高效生产果聚糖需以蔗糖为主要的培养基成分，应用优化后的培养基成分及发酵条件，发酵培养24 h枯草芽孢杆菌活菌数达到1×1010～1×1011CFU/ml，发酵液中功能多糖（果聚糖）含量≥100 g/l。如此高的果聚糖产量在枯草芽孢杆菌中并不多见，也正是由于其高产功能多糖的代谢特性，使得B.subtilisB6显示了良好的益生菌活性。

表1 不同碳源对B.subtilisB6发酵产果聚糖的影响（g/l）

2.2 枯草芽孢杆菌果聚糖的抗氧化活性

据报道果聚糖作为功能性多糖，通常具有抗氧化和抗肿瘤等生物学活性，本文应用DPPH自由基清除、ABTS自由基清除与铁还原能力指标来评价枯草芽孢杆菌B6所产果聚糖的抗氧化活性。结果如表2所示，随枯草芽孢杆菌B6果聚糖浓度的提高，其抗氧化能力随之增强，当果聚糖浓度达到10 mg/ml，其DPPH自由基清除率和ABTS自由基清除率分别达到80%和70%以上，铁还原能力也达到抗氧化剂组铁还原能力的69.6%。可见，枯草芽孢杆菌B6果聚糖具有较强的抗氧化能力，作为益生菌产生的重要代谢产物，对于清除动物体内自由基、提高免疫力、改善体质、提高抗病性将具有显著效果。

表2 枯草芽孢杆菌B6果聚糖抗氧化能力测定结果

2.3 枯草芽孢杆菌B6的应用特性

本文对B.subtilisB6的主要应用性能指标进行了详细测定，结果见表3所示，经过分析，枯草芽孢杆菌B6具有活菌数高，菌种性能强，生产成本低等诸多优势。同时，该菌株在生长过程中可产生淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶、半纤维素酶等消化酶类，可加强宿主体内的营养代谢。作为益生菌应用，B.subtilisB6也显示了良好的抗胃酸和耐高温等抗逆性能，其保存稳定及有效性也很优秀，因此，B.subtilisB6显示了非常良好的益生菌剂开发应用潜力。

2.4 枯草芽孢杆菌B6对母猪繁殖及育仔性能的影响

应用B.subtilisB6液体菌剂饲喂哺乳期母猪，结果如表4所示，与对照组相比，饲喂B.subtilisB6液体菌剂的母猪生产平均健仔数相对高，弱仔及死胎率相对低，平均窝重提高了28.8%，说明该益生菌剂对母猪生产具有显著的有益效果；同时，平均断奶窝重也较对照组提高了18%，通过观察，饲喂益B.subtilisB6液体菌剂的仔猪精神相对较好，显著缓解仔猪腹泻，可见B.subtilisB6液体菌剂具有显著提高母猪及仔猪免疫力的功效。

3 结论

本文针对一株高产果聚糖的枯草芽孢杆菌B6及其应用做了系统研究，该菌株作为饲用益生菌剂可产生功能性果聚糖作为良好的抗氧化剂，可增强动物机体免疫力和抗病性。菌株在生长过程中还可产生淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶、半纤维素酶等消化酶类，可加强宿主体内的营养代谢。应用该活体菌剂饲喂孕期母猪，可显著提高窝重，仔猪精神相对更好，显著缓解仔猪腹泻，显著提高母猪及仔猪免疫力。可见，枯草芽孢杆菌B6具有良好的益生菌开发潜力。

表3B.subtilisB6主要应用性能指标

表4B.subtilisB6液体菌剂对母猪繁殖及育仔性能的影响