自养硝化过程去除循环水养殖系统水体中氨氮的研究进展

罗国芝，吴慧芳，谭洪新

(1.上海水产养殖工程技术研究中心，上海 201306；2.上海海洋大学水产科学国家级实验教学示范中心，上海 201306；3.水产动物遗传育种中心上海市协同创新中心，上海 201306)

氮(N)是鱼虾体内核苷酸、蛋白质、氨基酸的主要构成元素之一。鱼虾的蛋白质需求高但消化吸收能力有限，相当一部分投喂饲料中的氮不能被利用。开放式养殖系统中未被利用的氮素被排放到周围水环境。封闭循环水养殖系统中通常利用固液分离去除掉残饵和粪便(约占投喂饲料的30%～60%)，其余未被利用的氮素以有机氮、氨氮、亚硝酸氮和硝酸氮的形式存在于养殖水体中[1]。氨氮是蛋白质代谢的最终产物之一，对水生动物有明显毒害作用，是养殖过程中主要控制的水质指标之一[2]。

养殖水体中主要有三种氨氮转化途径：藻类和水生植物进行的光合自养、硝化细菌进行的自养硝化和异养细菌进行的同化过程[3]。光合自养过程需要光照和较大的占地面积[2]。异养同化过程需要维持较高的有机物含量(C/N>20， w/w)[3]，而养殖水体C/N常小于2(w/w)[4]，需要加入有机物补充碳源。自养硝化过程是最普遍的一种氨氮转化方式，由CO2提供碳源，适宜于处理C/N较低的养殖水体[3]。

循环水养殖系统通过固液分离装置、固定膜式生物过滤器等水处理技术实现高密度养殖用水的重复利用。固定膜式生物过滤器的核心功能就是提供自养硝化细菌生长和代谢所需条件，将水体中氨氮经亚硝酸氮转化成硝酸氮[1]。本文根据国内外关于固定膜式自养硝化过程的研究报道，结合循环水养殖系统中的水体特征，分析了利用固定膜式自养硝化过程控制养殖水体氨氮的优势和劣势、在实际使用过程中的注意事项以及应用方式，为实际应用提供参考。

1 自养硝化过程

2 自养硝化细菌

自养硝化过程的氨氧化阶段和亚硝酸氧化阶段分别由氨氧化细菌(也被称为亚硝酸细菌)或氨氧化古菌和硝酸化细菌进行。常说的硝化细菌包括氨氧化细菌和硝酸细菌。 硝化细菌属化能自养型，生长效率和代谢效率比较慢。异养细菌的生长速率和繁殖速率分别是自养硝化细菌的5倍和2～3倍[3]。 异养细菌的特殊生长率为4.8/d，氨氧化细菌和亚硝酸氧化细菌的特殊生长率只有0.76 和 0.84/d[5]。

2.1 氨氧化细菌和氨氧化古菌

氨氧化细菌和氨氧化古菌都能氧化氨氮获取能量而生长，氨氧化单胞菌生长较快(世代时间7～8 h)、可以忍受高浓度氨氮(高于100 mmol/L)和亚硝酸(25 mmol/L)(纯培养条件下)[6]。越来越多的研究证明氨氧化古菌比氨氧化细菌要更加丰富。在封闭式养虾系统中古菌的氨氧化基因比细菌中的氨氧化基因要丰富[7]。氨氧化古菌 (CandidatusNitrosopumilusmaritimus)和氨氧化细菌(Nitrosospira)是海水养殖系统的生物过滤器中优势菌种[8](表1)。

表1 循环水养殖系统中生物过滤器中的硝化作用相关的细菌[7]Tab.1 Micro-organisms associated with recirculation aquaculture systems biofiltration

2.2 硝酸化细菌

一般认为，硝化作用的速率由硝酸化细菌决定，硝酸化细菌一直被认为只能依赖于其他微生物供应亚硝酸盐，对环境变化的反应要比氨氧化细菌敏感，耐低氧能力要比氨氧化细菌弱[9]。 大于0.01～1 mg/L的NH3和0.06～0.85 mg/L左右的HNO2-N对硝酸化细菌有抑制作用[10]。

3 循环水养殖水体中影响自养硝化过程的因素

循环水养殖系统中为了保证养殖对象的存活，氨氮和亚硝酸氮浓度保持在较低水平(氨氮低于3 mg/L，亚硝酸氮低于1.5 mg/L)[1]，不至于到抑制硝化细菌的程度。光照对自养硝化过程有抑制作用[11]。循环水一般都是在室内，光照不至于强到对自养硝化过程抑制的程度。在循环水养殖系统中，温度、盐度、pH、药物等是需要重点考虑的影响硝化过程的因子。

3.1 温度

温度是细菌的生长率关键决定因子之一，0～30 ℃条件下细菌都能维持一定的活性。在零下5 ℃的环境中也分离得到了氨氧化细菌[12]。高温条件容易导致细菌死亡，低温条件下细菌经过一段时间的适应也可能够获得较高活性，但繁殖率降低。所以低温条件下生物过滤器的启动时间较长。在温度低于5 ℃的条件下，即使培养时间长达3～4个月，硝化作用仍无法正常进行，9～26 ℃则会出现硝化作用。淡水系统以25～30 ℃最佳，海水硝化细菌以27～28 ℃最适宜[13]。但养殖水体温度的设定主要取决于养殖对象的需求，冷水性循环水养殖系统中的自养硝化过程需要重点关注。

3.2 盐度

盐度是影响硝化效率的重要因子，氨氧化细菌对盐度增加有较高的敏感性，高盐度条件下，硝酸化细菌对盐度的敏感性要比氨氧化细菌明显[14-15]，所以海水生物滤器启动过程中亚硝酸盐积累的时间要比氨氮积累的时间长[16]。海水细菌经过驯化后能够在较低盐度条件下存活，把海水换成淡水之后未见其活性停止[17]。淡水养殖系统中硝化作用的活性因为加入海水而降低，盐度升高到与正常海水相同时完全停止。盐度抑制硝化细菌的生长速率，也会改变细菌的生存策略，有盐度条件下，细菌会通过调整细胞质的渗透压适应环境；从能量代谢的角度，在有盐度条件下，细菌生存能耗较高，硝化细菌从同化代谢中获得的能量本就有限，盐度的存在会使硝化细菌的能量获取更加有限[18]。

不同盐度条件下生物膜的氨氧化细菌和硝酸化细菌的组成不同。淡水移动床生物膜反应器的生物膜中的氨氧化细菌包括亚硝化单胞菌属和亚硝化菌属，硝酸化细菌则主要为硝化螺菌属[19]。海水移动床生物膜反应器中的亚硝化单胞菌属和硝酸化细菌主要为硝化螺菌属[20]。咸淡水和海水生物过滤器中都存在亚硝化单胞菌属和亚硝化螺菌属[21]。亚硝化球菌只出现在咸淡水环境中，而嗜盐的亚硝化单胞菌属只在海水条件下，两种条件下硝酸化细菌均包括硝化菌属和硝化螺菌属。淡水、20%咸淡水和全海水的移动床生物膜反应器的生物膜菌群组成差异明显：咸淡水的组成丰度比淡水和海水都要低；亚硝化单胞菌属是氨氧化细菌的主要菌属；淡水中硝酸细菌主要为硝化菌属和硝化螺菌属，咸淡水和海水中是硝化螺菌属[22]。

3.3 溶解氧

硝化细菌为好氧细菌，低于60%饱和度的溶解氧会降低氨氮去除率[10]。溶解氧低于4 mg/L时，亚硝化单胞菌的活性降低，低于2 mg/L时，硝酸化菌的活性降低[23]。溶解氧太高对硝化细菌有抑制作用[24]。一般认为，生物过滤器中溶解氧最低浓度应保持在2 mg/L以上[3]。

水产养殖水体是富氧水体，为了维持养殖对象的生存，需要保证4 mg/L以上的溶解氧含量，所以生物过滤器进水中的溶解氧不会成为限制因子。但在实际使用过程中，某些类型的生物过滤器(比如浸没式或者滴滤式)体积比较大，水力停留时间较长，很难保证生物过滤器内部的溶解氧的充足供应，需要对反应器充氧以保证溶解氧在2 mg/L以上。

3.4 pH和碱度

纯培养条件下，亚硝化单胞菌和硝酸化菌最适宜生长的pH分别是8.1和7.9，在非纯培养条件下的结果可能会有所不同[25]。pH在6.6时，氨氧化细菌和亚硝酸氧化细菌的生长率相等，pH低于6时AOB的活性很明显降低，亚硝酸氧化细菌对低pH的适应能力要高于氨氧化细菌[26]。氨氧化细菌的活性随着pH的升高而升高，pH值在 5.0～8.5之间时每升高1.0，硝化效率提高13%[27]。

维持适宜的碱度水平对硝化过程至关重要，40 mg CaCO3/L被认为是能够进行自养硝化的最低碱度水平，碱度从115 CaCO3mg/L (pH 7.3) 降低至57 CaCO3mg/L(pH 6.7) 时，生物过滤器的硝化效率减少约50%[28]。Chen 等[29]认为在水交换较低的条件下，水体中的碱度应维持在200 mg CaCO3/L以上。碱度低的时候，pH波动比较明显，微生物结构也不稳定，氨氮和亚硝酸去除效率会降低。

3.5 溶解性有机物和C/N

硝化细菌属于典型的自养细菌，有机物对于硝化细菌是否具有毒害作用是人们普遍争论的问题。在一定的C/N范围内，随着C/N的升高，硝化作用效率降低，超过一定的范围，C/N对硝化作用的影响不明显[30]。循环水养殖系统中溶解有机碳以腐殖酸为主，细菌可利用性程度比较低，即使C/N高出了自养细菌的适宜范围，在固液分离正常运转的情况下，对硝化作用效率的影响不大[31]。也有研究者认为，有机物对硝化细菌可能没有毒害作用，而是刺激异养细菌迅速生长，从而与硝化细菌竞争溶解氧、氨和微量营养物质，使硝化细菌的生长受到限制[32]。有机物的存在刺激异养细菌的生长，异养菌的同化降低了参与自养硝化过程的氨氮的利用率，异养细菌的聚集会抑制氨氧化过程[33]。循环水养殖系统中固液分离会除掉大部分的残饵和粪便，水体中C/N一般2以下[2]，对硝化细菌的影响不明显。

3.6 药物及有毒物质

臭氧生成的氧化物( OPO)在浓度大于 0.05 mg/L的条件下对生物过滤器硝化作用有明显抑制作用，在初始浓度0.6 mg/L的OPO 中暴露1 h，氨氧化细菌和硝酸细菌仍有硝化活性[34]。

养殖系统中会使用一些鱼药等化学制剂，应该考虑这些化学药剂是否对生物过滤器中的细菌有抑制和杀伤作用。1.0 mg/L的过乙酸对硝化过程有短暂的影响，100 mg/L的过氧化氢对硝化过程去除氨氮的能力有明显的抑制作用，需要10 d才能恢复，35 mg/L的过氧化氢对硝化过程的影响需要2 d恢复，即使很小剂量的硫化氢也会影响硝化过程的效率[35]。生物膜会对硝化细菌起到一定保护，常用剂量的大多数鱼药不会对海水生物过滤器造成明显影响，即使有，也能较短时间内恢复[36]。

4 自养硝化过程的建立

生物反应器的启动是常规的步骤，自养硝化过程的启动尤其必要，一方面使滤料表面微生物大量繁殖生长，形成生物膜，高效地净化废水，另一方面使滤料生物膜的微生物群能逐渐适应养殖环境。建立完整的硝化作用需要有一定的启动时间，21～26 ℃时需要28～60 d，低温或者海水环境需要的时间更长，盐度为35的海水建立完整的硝化作用需要75 d左右，28～30 g/L的盐度、18 ℃水温的条件下建立硝化过程需要70 d，海水养殖系统甚至2～3个月都比较常见[17，37]。如果硝化过程没有被完整建立，中间通过换水减少氨氮和亚硝酸的积累而不是通过自养硝化过程自身完成氨氮或亚硝酸的转化，在运行过程中氨氮或者亚硝酸会一直有积累。如果完成了硝化作用的建立过程，在设计负荷内生物过滤器会保持稳定的处理能力，养殖系统正常运行过程中基本不会出现氨氮或者亚硝酸的明显积累。

4.1 自养硝化过程的建立

首先要保证为硝化细菌的生长和存活尽可能提供最适宜条件，启动过程中需要提供自养硝化过程需要的温度、溶解氧、pH、碱度，还需要提供3～5 mg/L的氨氮。可加入碳酸氢钠维持150 mg CaCO3/L左右的碱度以满足亚消化单胞菌细菌的生长，亚硝化单胞菌细菌需要200～250 mg CaCO3/L的碱度，硝化菌属稳定后碱度可以适当降低。碱度合适的条件下，pH可以维持在6.8～7.2。培养过程中加入有机物能够促进滤料表面微生物繁殖，微生物的繁殖进一步促进有机物的分解与吸附。硝化细菌适应低温的能力较强，适应后也能具有高效的硝化能力。可以通过逐渐提高盐度的方法加快海水处理系统的生物过滤器的建立。

除了满足硝化细菌需要的环境理化因子需求外，添加商业的硝化细菌是否能促进自养硝化过程的建立存在争议。有研究结果表明添加商业硝化细菌可以明显促进硝化作用的建立和效率[38]。但也有研究表明，添加商业硝化菌并没有促进海水生物过滤器的启动[16]。

实际生产过程中也可以不进行生物过滤器的预先培养，直接饲养养殖动物，称为“冷启动”。在养殖宝石鲈(Scortumbarcoo)的系统中直接培养生物过滤器需要37 d，启动过程中亚硝酸盐积累到20 mg/L以上，氨氮、亚硝酸氮波动明显；生物过滤器功能建立后，即使中后期投饵量大量增加，系统中水质情况一直保持良好状态[39]。需要注意的是，选择采用“冷启动”方法时要重点考虑养殖对象的种类，比如罗非鱼(Oreochromisniloticus)可以，但虹鳟(Oncorhynchusmykiss)就存在较大风险。

4.2 硝化过程建立成功的标准

培养中的生物膜系统中微生物群的数量及其活性达到某一程度(一般情况下，生物膜的厚度达到1.2～2.2 mm)，微生物的氨化、亚硝化、硝化同时进行，可认为培养过程完成。当出现下列情况时，可以作为生物滤器生物膜成熟的判定：处于不断上升的亚硝酸盐骤然下降(图1)[40]，出水中氨氮和亚硝酸保持较低浓度，硝酸盐明显积累。

图1 生物过滤器启动氨氮、亚硝酸氮和硝酸氮的变化趋势Fig.1 The changes of TAN， nitrite-N and nitrate-N during the acclimation period of a bead filter

5 展望

自养硝化过程是目前循环水养殖系统中最常用的氨氮控制途径，结合养殖水体的特点，需注意以下几点：应用过程中应首先进行完整硝化过程的建立；硝酸细菌比氨氧化细菌对环境更敏感，因此系统中容易出现亚硝酸盐的积累；需要定期补充碱度；温度、盐度、pH、碱度、溶解氧是影响硝化作用处理养殖水体的主要因素；生物过滤器启动完成后会获得比较稳定的处理效能。

为了获得更高效的应用自养硝化过程控制养殖水体中的氨氮，需要开展以下研究：水产养殖环境中能够稳定进行硝化过程的细菌种类，硝化功能基因的表达水平的决定因素以及古菌在水产养殖水体硝化过程的作用效率和机理等。