不同碱度下普通小球藻对焦酚的响应研究

（河南师范大学水产学院，河南新乡453007）

微囊藻是一类全球性分布的蓝藻，在我国大部分富营养化水体中，铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa)在数量和发生频率上均占优势[1]。铜绿微囊藻的大量繁殖不仅使水体溶解氧含量下降，破坏生态系统平衡，而且能释放对其他生物有害的微囊藻毒素，是饮用水污染的来源之一，因此，抑制有害蓝藻繁殖，控制水华暴发，已成为近年面临的挑战。普通小球藻(Chlorella vulgaris)是养殖水体的常见有益藻种之一[2]。小球藻生长旺盛并成为优势种是良好水质的重要标志。因此，在渔业水体尤其是养殖水体中，如何有效抑制铜绿微囊藻等有害蓝藻，促进普通小球藻等绿藻生长繁殖成为一个重要课题。

20世纪30年代以来，一些专家学者在水生植物分泌具有抑藻活性的物质筛选、提取和鉴定方面做了大量工作[3]。穗花狐尾藻是淡水湖泊中常见的沉水植物，Nakai等研究发现狐尾藻分泌的多酚化合物能抑制蓝藻生长，并且进一步证明其中含有焦酚等多酚类物质[4]。尽管已有研究证明焦酚对蓝藻较强的抑制效果，但对绿藻的影响还不清楚。我们的前期实验发现碱度增加可促进焦酚对蓝藻的抑制，不同碱度条件下绿藻对焦酚的响应还不清楚。

1 材料与方法

1.1 材料及培养条件

实验所用藻种普通小球藻来自中国科学院水生生物研究所培养物保藏中心淡水藻种库。保种和实验期间均用无菌BG11培养基，在2000lx，12h:12h光暗比，(25±1)℃的条件下培养。实验所选化感物质焦酚购自Sigma-Aldrich公司(美国)，Folin-Ciocalteu试剂购自北京索莱宝科技有限公司(中国)。

1.2 实验设计

实验以绿藻中的普通小球藻为受试藻，设置焦酚处理组和对照组，处理组焦酚浓度均为5.0 mg L-1，分别设置0.38、1.51和6.04 mmol L-1等3个碱度水平，表示为0.38+、1.51+、6.04+。对照组碱度水平为0.38 mmol L-1，无焦酚添加。每组三个平行，实验采用100 mL培养体系，试验期间，每天早晚手动摇动锥形瓶各一次，促进营养循环，减少藻类下沉和贴壁效应。

在实验开始后的第0、3、6、9天分别取样测定各实验组的藻细胞密度、培养液pH值，实验开始和结束时测定培养液碱度。

1.3 指标测定

实验的测定指标包括pH值、碳酸盐碱度、碳酸氢盐碱度、总碱度、以及普通小球藻细胞密度。其中，pH值采用酸度计测量，显微镜计数法测量藻细胞密度，碱度采用酸碱滴定法测定[5]。抑制率为对照组与处理组细胞密度差值占对照组的百分比。

2 结果

2.1 不同碱度水平下焦酚对普通小球藻的影响

图1显示，焦酚对普通小球藻的生长有一定影响，但不同碱度下影响程度不同。在0～6天，当碱度为0.38、1.51和6.04 mmol L-1时焦酚均能显著抑制普通小球藻生长。在第6～9天，当碱度为6.04 mmol L-1时，焦酚不再抑制普通小球藻生长。从图2可以看出，三种碱度在0～3天的抑制率均随时间不断增加，在整个实验周期第3天的抑藻效果最好。6.04+实验组在第3天抑制率达到最高。在第3～9天，0.38+、1.51+和6.04+实验组的抑制率都有所下降，但6.04+实验组下降幅度较大，在第9天，6.04+实验组的抑制率为-3.0%，与对照组相比表现出对小球藻生长的促进作用。

图1 不同碱度水平5 mg L-1焦酚作用下普通小球藻的生长曲线，0.38+、1.51+、6.04+分别表示碱度为0.38、1.51和6.04 mmol L-1的焦酚处理组，下同Fig.1 The growth curves of Chlorella vulgaris exposed to 5 mg L-1pyrogallol at different alkalinity levels,0.38+,1.51+and 6.04+respectively represent pyrogallol treatment groups with alkalinity of 0.38,1.51 and 6.04 mmol L-1.The same below

图2 不同碱度水平下5 mg L-1焦酚对普通小球藻的生长抑制率Fig.2 The growth inhibition rate of 5 mg L-1 pyrogallol on C.vulgaris at different alkalinity levels

2.2 pH值和碱度的变化

实验初期，每个实验组的碱度不同，pH值也不同，碱度越大的实验组，pH值越高。

从图3可以看出初始碱度较大的实验组，pH值较高。1.51+和6.04+实验组由于实验初期碱度较大，则pH值开始较大，但在第0～3天，pH值下降，第3～9天，pH值缓慢增加。1.51+和6.04+实验组在第9天的pH值分别为8.53和9.14，低于第0天的pH值（8.83、9.44）。对照组和0.38+实验组的pH值随着暴露时间的增加逐渐增加，在整个试验周期对照组的pH值大于0.38+实验组。

图3 不同碱度水平5 mg L-1焦酚作用下培养液中pH值的变化动态Fig.3 Changes of pH value in culture solution exposed to 5 mg L-1pyrogallol at different alkalinity levels

图4表明了各实验组中总碱度、碳酸盐碱度和碳酸氢盐碱度的变化情况，总碱度和碳酸氢盐碱度的变化趋势一致。在实验第0天，对照组、0.38+、1.51+和6.04+实验组的总碱度分别为0.40、0.40、1.46、5.99 mmol L-1，添加碱度和实测总碱度大致相同，对照组和0.38+实验组只存在碳酸氢盐，但是1.51+和6.04+实验组，碱度由碳酸盐和碳酸氢盐组成。第9天，对照组、0.38+、1.51+和6.04+实验组的总碱度分别为1.55、1.08、2.55、7.07 mmol L-1，对照组和0.38+实验组同样只存在碳酸氢盐，并且碳酸氢盐的碱度增加，1.51+和6.04+实验组的碳酸盐碱度降低，碳酸氢盐碱度增加。在整个实验周期碳酸氢盐占主导地位，碳酸氢盐碱度和总碱度的变化趋势一致。

3 讨论

近年来化感效应抑制水体中的水华藻类颇受关注，一些水生植物通过向水中分泌化感物质来抑制藻类生长[6]。焦酚是一种植物化感作用合成并释放到环境中的带有多个羟基的多酚类化感物，已有研究表明焦酚对蓝藻中的铜绿微囊藻和绿藻中的小球藻都具有抑制作用[7]。但在不同碱度水平下焦酚对两种藻的影响趋势不同。随着碱度的增加焦酚对铜绿微囊藻的抑制作用增强，但碱度为6.04 mmol L-1时，第9天的普通小球藻细胞密度大于对照组，焦酚不再抑制普通小球藻生长。铜绿微囊藻和普通小球藻分别为蓝藻和绿藻的常见藻类，通过调节碱度水平进一步增强焦酚对蓝藻的选择性抑制，对有效控制蓝藻水华意义重大。

溶解于水体中的无机碳共有4种存在形式：CO2、H2CO3、CO32-和HCO3-，它们之间存在着一定的动态平衡转化关系。影响实验组pH值变化的因素有2个作用相反的方面，分别是藻类光合作用吸收利用无机碳源（CO2和HCO3-）和藻类呼吸作用释放CO2。藻类生长过程中，利用水体中游离态CO2和HCO3-进行光合作用，H+浓度减少，故pH值增大。而藻类呼吸过程释放二氧化碳，pH值将下降。图3中不同实验组的pH值变化就是这两个过程的综合作用结果。pH值升高，表明这个时期普通小球藻生长旺盛，生长过程吸收利用二氧化碳和碳酸盐对水中pH值的影响比呼吸过程释放二氧化碳的影响大，pH值下降时作用机制则相反。

碱度是水体综合性特征指标，代表能被强酸滴定的物质的总和，是金属离子以及CO32-和HCO3-水解导致的pH值变化[8]。大多自然水体碱度为2.0～2.5mmol L-1，pH为6.5～8.5，呈弱碱性[9]。已有研究表明小球藻较适宜在弱碱环境中生长[10]，实验表明，pH在7.17～9.14的范围内普通小球藻的细胞密度均有不同程度的变化，pH从低到高，普通小球藻细胞密度呈抛物线变化，其中pH在9.14时达到最高，表明小球藻较适宜在弱碱环境中生长。所以实验选取0.38、1.51和6.04mmol L-1的碱度，不仅有利于观察不同碱度下普通小球藻对焦酚的响应机制，更有利于将此应用到自然水体的藻相调控。

4 结论

碱度水平会影响焦酚对普通小球藻的作用效果，0.38和1.51mmol L-1碱度水平下焦酚显著抑制普通小球藻生长，暴露9天后抑制率分别为45.0%和 49.0%，而碱度为6.04mmol L-1时焦酚抑制率为-3.0%，普通小球藻细胞密度高于对照组。这与我们前期对铜绿微囊藻的研究结果不同，高碱度水平下焦酚对铜绿微囊藻抑制作用增强，对普通小球藻抑制作用减弱，为蓝藻水华的选择性生态控制提供了思路。