投喂率和投喂频率对吉富罗非鱼幼鱼生长和肝脏健康的影响

刘 伟， 文 华， 蒋 明， 吴建军， 吴 凡， 田 娟， 陆 星，喻丽娟

(1.中国水产科学研究院长江水产研究所，农业农村部淡水生物多样性保护重点实验室， 武汉 430223；2.武汉新华扬生物科技有限公司， 武汉 430074)

投饲技术是鱼类养殖成功与否的关键因素。投饲技术包括投喂率、投喂频率、投喂节律和投喂地点等。其中，投喂率和投喂频率对鱼类的生长和饲料利用效率影响最为显著[1]。一般认为，适宜的投喂频率可以促进鱼类的生长，降低鱼类个体分化，提高存活率和饲料利用率，减少残饵和代谢废物排放对养殖环境的污染[2]。适宜的投喂率在最大限度满足鱼类正常生长的同时也可以节约饲料成本[3]。同时，投喂率[4]和投喂频率[5]也会对鱼类健康产生影响。因此，寻求最佳的投喂率和投喂频率是水产养殖成功的关键环节之一。

罗非鱼是联合国粮农组织(FAO)向全世界推广的优良水产养殖对象。自2011年以来，我国的养殖产量一直稳定在140万吨以上，位居世界首位。研究发现，罗非鱼的投喂率或投喂频率随体重的增加而降低[6-8]。但是，受到实验环境、饲料质量、养殖品种或品系等因素的影响，即使相同规格的罗非鱼，其适宜投喂率或投喂频率的研究结果差异明显。如在封闭循环系统中养殖的初始体重60 g的奥利亚罗非鱼(Oreochromiscoaureus)，其最适投喂率仅为2%[9]，而在水泥池网箱中养殖的初始体重72 g的吉富罗非鱼(GIFT，Oreochromisniloticus)，其投喂率可达6.21%[10]。早期推荐适宜水温下5～25 g的罗非鱼，最佳投喂率为4%，最佳投喂频率为4次/d[11]；但最近对体重5～16 g的吉富罗非鱼的研究则发现，最佳投喂率为6%，最适投喂频率为2次/d[7]。此外，有关投喂率和投喂频率对罗非鱼生理健康影响方面的研究报道也较少。吉富罗非鱼是经过遗传性状改良后的尼罗罗非鱼，其生长速度较其他品系快5%～20%[12]，是我国罗非鱼养殖中主要养殖品系之一，其养殖面积曾占我国罗非鱼养殖面积的60%以上[13]。因此，本研究以吉富罗非鱼为研究对象，通过研究不同投喂率和投喂频率对其生长、饲料利用、体成分、肝脏组织学结构和部分生理生化指标的影响，探讨投饲技术对罗非鱼生长和健康的影响，以期为罗非鱼饲料的合理使用提供参考资料。

1 材料与方法

1.1 实验饲料

以豆粕、菜粕、鱼粉等为原料，配制成蛋白水平为33.5%，脂肪水平为6.9%的实用配方饲料(配方见表1)。将各种原料粉碎，过60目筛，按饲料配方称重后充分混匀，利用小型绞肉机制成直径为2 mm 的成品饲料，自然风干，破碎后，置于- 20℃冰箱中储藏备用。

1.2 实验鱼

实验鱼来源于湖北省罗非鱼原良种场。运回后，暂养在4个直径1 m (有效容积400 L)的循环水养殖系统中，使实验鱼恢复体质，并适应养殖环境。暂养期间每天表观饱食投喂2次(8∶30和16∶30)实验饲料。2周后，选择规格整齐，表观健康的720尾鱼，随机分养于24个循环水养殖桶中(有效容积100 L)，每桶放鱼30尾。实验鱼的平均体质量(3.78±0.01) g。

1.3 实验设计和饲养管理

采用2×4双因子实验设计，共计8个处理组，每个处理组设置3个重复。依据资料[6，15-16]，本研究的投喂频率(FF)设定为2次/d(8∶30和16∶30)和3次/d(8∶30，12∶30和16∶30)。在前期的驯养阶段发现，实验鱼采用表观饱食投喂，每天投喂2次，每次投喂15 min，通过计算可得每日的投喂率(FR)约为10%。据此，投喂率设定为8%，10%，12%和表观饱食投喂。在投喂过程中，根据投喂频率，平均分配每次的投喂量，每次投喂30 min。实验持续30 d。每隔10 d称重1次，以每个处理的平均体质量和成活率，并根据投喂率调整投喂量。养殖期间采用自然光照，水流2 L/(min·桶)，水温(30.1±0.6) ℃，溶解氧>5 mg/L、氨氮浓度<0.5 mg/L、pH6.8～7.5。

表1 饲料配方及营养组成Tab.1 Formulation and nutrient composition of the diet

1.4 样品制备、分析和指标计算

实验开始20 d后，在罗非鱼排便高峰期的20∶00～21∶00，用密网捞取并挑选条状成型、饱满的粪便，放入培养皿中，在-40 ℃的冰箱中冷冻后，放入真空冷冻干燥机中，冷冻干燥72 h。取出，粉碎过45目筛，放入样品袋中，于-40 ℃的冰箱中保存。每天收集粪便1次，直至收集的粪便足够分析为止。

实验结束后，禁食24 h，麻醉(MS-222，150 mg/L)后，对每桶实验鱼进行计数和称体质量。每桶随机取鱼3尾，测量体长和体质量，用于计算肥满度；并于尾静脉取血，混合后于4 ℃冰箱内静置2 h，以3 000 r/min 的转速离心15 min，得到空腹血清，保存于-80 ℃冰箱中，用于测定血清生化指标；随后取肝脏、内脏并称重，用于计算肝体比、脏体比；取同一部位的部分肝脏，放于4%多聚甲醛溶液中，用于检测肝脏组织结构。去内脏全鱼、肝脏和内脏分别保存于-20 ℃冰箱中，用于测定常规营养成分。另每桶随机捞鱼3尾，取其背鳍以下侧线以上的肌肉，保存于-20 ℃冰箱中，用于测定常规营养成分。

测定方法：直接干燥法测定水分含量(GB/T 5009.3-2003)；凯氏定氮法测定粗蛋白质含量(GB/T5009.5 - 2003)；索氏抽提法测定粗脂肪含量(GB/T 5009.6- 2003) ；灼烧称重法测定灰分含量(GB/T 5009.4- 2003)；电感耦合等离子质谱法测定Y2O3含量(GB/T 18115.1)。

使用日本希森美康(CHEMIX -800)全自动生化分析仪测定8种血清生化指标：总蛋白(TP)、球蛋白(ALB) 、碱性磷酸酶(ALP)、谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)、血糖(GLU)、甘油三酯(TGK) 和总胆固醇(TCHO)。

肝组织标本固定后石蜡包埋，连续切片，HE染色，光镜下逐片观察及照片，运用图像分析软件(Image Pro Plus 6.0)对HE染色结果进行处理。每块组织随机选择4张照片进行分析。

其余各指标的计算公式如下：

增重率 (WG)=(W1-W0)/W0×100%；

特定生长率 (SGR)= (lnW1-lnW0)/t×100%；

饲料效率 (FE)= (Wf-Wi+Wd)/WA；

蛋白质效率 (PER)= (Wf-Wi+Wd)×100% /Wp；

成活率 (SR)=Nf/Ni×100%；

肥满度 (CF)=W/L3×100；

肝体比 (HSI)=WH/W×100%；

脏体比 (VSI)=WV/W×100%；

饲料成本 (FC)=WA×F/ (Wf-Wi+Wd)；

干物质表观消化率(AD)=100%×(1-Md/Mf)；

营养物质表观消化率(ADCd)=100%×[1-(Nf/Nd) ×(Md/Mf)]。

式中，t为实验天数(d)，W0和W1分别为实验鱼的初、末均体质量(g)，Wi、Wf和Wd、Wp分别为实验鱼的初、末总体质量(g)、死亡鱼的体质量(g)和摄入饲料粗蛋白含量(g)，W为鱼体质量(g)，L为鱼体长(cm)，WA为投喂饲料总质量(g)，Ni和Nf分别为实验结束后和开始时鱼的尾数，WH、WV和W分别为肝胰脏、内脏质量和体质量(g)，F为配方成本(元/kg)，Md为饲料中标记物含量(%)，Mf为粪便中标记物含量(%)，Nd为饲料中营养成分的含量(%)，Nf为粪便中营养成分的含量(%)。

1.5 数据分析

2 结果

2.1 生长和饲料利用

投喂率和投喂频率对吉富罗非鱼幼鱼生长和饲料利用的影响见表2。由表2可见，投喂率和投喂频率对实验鱼的平均末体质量、增重率(WG)、特定生长率(SGR)和肝体比存在显著的交互作用。投喂率由8%增加到12%时，实验鱼的WG、SGR和饲料成本显著升高。表观饱食组实验鱼的WG和SGR显著高于投喂率为8%的，而与其他组差异不显著；但其饲料效率(FE)和蛋白质效率(PER)与投喂率为8%组的差异不显著，显著高于其他组。随投喂率由8%增加到12%，饲料成本(FC)增加，实验鱼的成活率逐渐升高。投喂率为12%组的FC显著高于其他组，表观饱食投喂组的FC最低，但与8%和10%投喂率组的差异不显著，而显著低于12%投喂率组。投喂率和投喂频率对实验鱼的肥满度和脏体比无显著影响，但对肝体比影响显著。投喂率为8%组实验鱼的肝体比显著小于投喂率为10%组的，而与其他组差异不显著。由表2亦可见，投喂率和投喂频率对实验鱼的表观消化率的影响不显著，但随投喂频率的增加，表观消化率有改善的趋势。

表2 投喂率和投喂频率对吉富罗非鱼幼鱼生长和饲料利用的影响Tab.2 Effects of feeding frequency and feeding level on growth performance and feed utilization of GIFT tilapia

注：表中值为平均值±标准差(n=3)，同列数据肩标小写字母不同，表示差异显著(P<0.05)。APD，饲料粗蛋白表观消化率。

2.2 体成分

投喂率和投喂频率对吉富罗非鱼幼鱼体成分的影响见表3。由表3 可见，仅发现投喂率对实验鱼的肝脏粗脂肪，以及去内脏全鱼的水分和粗脂肪具有显著影响；而投喂频率对体成分无显著影响。增加投喂率使得肝脏粗脂肪和去内脏全鱼的粗脂肪含量增加，而去内脏全鱼水分含量逐渐降低。表观饱食投喂组实验鱼的肝脏粗脂肪和去内脏全鱼水分含量与其他组差异不显著，但其去内脏全鱼粗脂肪含量显著高于投喂率为8%组，而与其他组差异不显著。

表3 投喂率和投喂频率对吉富罗非鱼体成分的影响Tab.4 Effects of feeding frequency and feeding level on body composition of GIFT tilapia% 湿重

2.3血清生化指标

投喂率和投喂频率对吉富罗非鱼幼鱼血清生化指标的影响见表4。由表4可见，投喂率对血清的谷草转氨酶活性(AST)和血糖水平有显著影响，而投喂频率仅对血糖水平有显著影响。10%投喂率组实验鱼的血清AST活性显著高于投喂率8%组的。随投喂率的增加，血糖水平逐渐增加，表观饱食投喂组的血糖水平与10%和12%组差异不显著，但显著高于8%投喂组；随投喂频率的增加，血糖水平降低。投喂率和投喂频率对血糖水平存在交互作用。

表4 投喂率和投喂频率对吉富罗非鱼血清生化指标的影响Tab.4 Effects of feeding frequency and feeding level on serum biochemical indexes of GIFT tilapia

2.6 肝脏组织结构

在本实验中，各处理组实验鱼的肝细胞结构基本正常，细胞膜和细胞核清晰可见，所有处理组均发现有细胞核偏移和空泡现象，但未发现明显的细胞膜溶解及炎症细胞浸溶等病理现象。投喂率和投喂频率对吉富罗非鱼肝组织形态的影响见表5。由表5可知，投喂率和投喂频率对实验鱼肝细胞核的面积比例无显著影响，但对其肝细胞空泡、细胞质面积比例有显著影响。随投喂率的增加，实验鱼肝脏空泡面积比例有增加的趋势，表观饱食组实验鱼的肝脏空泡面积最高，而细胞质面积最小。投喂率为8%，投喂频率为2次/d实验鱼的肝细胞空泡和细胞质面积比例与表观饱食投喂3次/d之间差异显著。

表5 投喂率和投喂频率对吉富罗非鱼肝组织形态的影响Tab.5 Effects of feeding frequency and feeding level on liver structure of GIFT tilapia

3 讨论

3.1 投喂率和投喂频率对吉富罗非鱼幼鱼生长性能和饲料利用的影响

本实验的结果发现表观饱食投喂3次/d实验鱼的饲料效率最佳，但其生长性能与饲料成本均与投喂率为10%实验鱼的无显著差异(表2)，表明以10%的投喂率，投喂 2次/d是适合吉富罗非鱼幼鱼生长的。在本实验中，随投喂率和投喂频率的增加，实验鱼的生长性能得到提高，这与小丑鱼(Amphiprionpercula)[17]、大盖巨脂鲤(Colossomamacropomum)[18]的研究结果类似。但在8%～12%的投喂率下，投喂频率未影响实验鱼的生长，这与已有罗非鱼的研究类似[7，19]，表明罗非鱼的生长依赖于食物的摄入量[2]。本实验中，表观饱食投喂3次/d具有较佳的生长性能和饲料利用效率，推测原因是每餐进行表观饱食投喂，实验鱼每餐均可根据其生理需要保持最佳摄食量，从而更利于其生长并节约饲料。

随投喂率由8%增加到12%，实验鱼的饲料效率逐渐降低，这与尼罗罗非鱼(Oreochromisniloticus)的研究结果类似[20]，表明鱼类的摄食量及消化吸收有一定限度，即存在一个最适和最经济的投喂率，过高不但不会获得最佳的生长速度，而且会造成饲料的浪费，增加养殖成本[3]。表观饱食投喂组的饲料效率与投喂率为8%组的差异不显著，但高于投喂率为10%和12%组，这与杂交斑点叉尾鮰(Ictaluruspunctatus×I.furcatus)的研究结果类似[21]，表明表观饱食投喂更利于饲料利用和节约成本。在本实验中，实验鱼对饲料营养物质的表观消化率未受投喂率和投喂频率的影响，类似的研究结果在投喂率和投喂频率对大西洋鲑(Salmosalar)的影响研究中也有所发现[22]。这可能与本实验的投喂率与其最适生长所需的较为接近所致。Sajjadi[23]在对大西洋鲑(Salmosalar)适宜投喂率的研究中发现，与维持最大生长投喂率的实验鱼相比，相近的投喂率并未影响生长和营养物质的表观消化率；同时，Xie等[24]也发现表观饱食的尼罗罗非鱼与相近的投喂量之实验鱼的生长，以及饲料粗蛋白、能量等的表观消化率无显著差异。

肝体比、脏体比和肥满度是评价鱼类营养生理状况的常用指标[25]。本实验中，投喂频率3次/d实验鱼的肝体比显著高于投喂2次/d的，且本实验中投喂率为10%组实验鱼的肝体比显著高于8%投喂率组的，这是因为肝脏作为鱼类的营养物质代谢的主要器官，提高投喂率和投喂频率增加了营养物质的积累[25]，造成了肝脏重量增加，进而肝体比提高。本实验中，实验鱼在投喂率由8%升高至12%时的成活率有不显著的升高，但是投喂率为8%的实验鱼的成活率显著低于表观饱食投喂组，这可能与低投喂率下，鱼类的免疫力受到抑制，造成成活率偏低有关[26]。

一般来说，鱼体成分中的脂肪和水分呈相反关系，蛋白质含量相对稳定[25]。本实验中投喂频率和投喂率对罗非鱼肝脏、肌肉、去内脏全鱼及内脏粗蛋白质含量均无显著影响。但随投喂率的增加，去内脏全鱼和肝脏水分含量有降低趋势，粗脂肪含量有升高趋势，这与摄食量的增加，造成了能量物质的摄入增加，进而转化成脂肪含量有关。

3.2 投喂率和投喂频率对吉富罗非鱼幼鱼肝脏健康的影响

血液可以客观反映养殖动物的营养代谢状况，是重要的生理学、病理学和毒理学指标，对于研究机体新陈代谢和生理状况具有重要意义[27]。当肝脏病变而引起细胞通透性增加，或受损伤的范围较大时，细胞内的转氨酶大量释放出来进入血浆，血液中ALT与AST活性升高[28]。但是，在正常代谢过程中，血清中 AST 和 ALT 活性值也会维持一定水平，它们活性高低同时也反映了蛋白质合成和分解代谢的状况[29]。本实验中，各处理组间血清AST并无显著差异，但是固定投喂率时发现，10%投喂率组实验鱼的血清AST活性要高于8%投喂率组的，而这两组间在数值上仅相差11 U/L，同时，在进行切片观察时，也未发现肝细胞有损伤或融合的现象，因此，这需要进一步研究不同投喂率下罗非鱼的蛋白质代谢水平。

肝脏在糖代谢和血糖调节中发挥着重要作用。当机体能量充足时，从消化道吸收的过多血糖以糖原形式储存于肝脏内；饥饿或禁食状态下，肝内糖原被分解并磷酸化为6-磷酸葡萄糖，再在葡萄糖-6-磷酸酶的作用下转化为葡萄糖释放入血，供机体能量代谢[30]。在本实验中，投喂率的提高使得血糖水平升高，类似的结果在对团头鲂(Megalobramaamblycephala)[5]、虹鳟(Oncorhynchusmykiss)[31]的研究中都有所发现，表明鱼类的碳水化合物的消化或代谢增加[26]。

覃希[7]对吉富罗非鱼幼鱼的观察发现，投喂率为6%的实验鱼(实验末体质量约20 g)肝脏空泡面积小于投喂率为8%和10%的实验室。但在本实验中发现，投喂率8%～12%的实验鱼间未发现显著的差异，而表观饱食投喂组肝细胞的空泡面积比例较高。通常认为，空泡含有脂质和糖原，这与肝脏的正常代谢功能有关[32]。一些研究表明，肝脏中脂质和糖原沉积的升高是一种真正的营养病理，并可导致进行性器官病变[33]，对鱼的健康造成不良影响[34]。然而，在本实验中，有关肝脏健康状况评价的血清指标，如TP、ALB、ALT、TCHO和TG，各组间并未显现出明显的差异，这似乎表明实验结束时鱼的肝脏健康状况尚比较稳定，造成空泡面积增大的原因应该是实验鱼的生理适应[35]，但这也同时预示着长期表观饱食投喂，可造成肝脏营养负荷过重。

综上所述，在本实验条件下，以生长和饲料利用为判断指标，吉富罗非鱼采用表观饱食投喂3次/d时，可以获得最佳的生长性能和饲料利用效率，但会产生体脂肪积累过多，肝脏细胞空泡增大等影响；若综合考虑生长和养殖成本，以10%的投喂率，投喂2次/d为宜。