不同启动子调控的两种半纤维素酶 分泌表达的比较

熊海容，汪斌，杨青，张莉

(中南民族大学 生命科学学院， 武汉 430074)

半纤维素酶(hemicellulase) 是分解半纤维素一类酶的总称，主要包括β-葡聚糖酶、半乳聚糖酶、木聚糖酶和甘露聚糖酶.半纤维素酶可将木质纤维性材料生物转化为单细胞蛋白、乙醇或其他有用物质，对其酶法水解还可得各种低聚糖，以低聚糖为功能性食品日益受到重视[1].因此，半纤维素酶已广泛地应用于食品、饲料、造纸等行业，但如何提高半纤维素酶的表达量使其更为高效的应用于工业生产中显得尤为重要.

启动子通过与转录因子相互作用控制基因转录的起始和表达水平，是一种重要的基因表达调控原件，启动子活性高低在较大程度上影响蛋白的表达水平[2].蒋慧慧等[3]以绿色荧光蛋白为报告基因，比较PScgpd，PGAP和PAOX1启动子的调控效果，结果显示PAOX1调控绿色荧光蛋白表达的效果最好，PScgpd效果最弱.因此，不同启动子调控同一外源蛋白能力相差较大，寻找活性较高的启动子对提高外源蛋白的表达量具有重要意义.

巴斯德毕赤酵母表达系统是目前常用的真核表达系统，甲醇诱导型启动子PAOX1在该表达系统中的应用最为广泛，已成功诱导多种外源蛋白在毕赤酵母中高效表达[4-6].但甲醇不适用于食品、医药等生产，且在大规模生产中存在火灾安全隐患[7].其他启动子如PFLD1,PGAP,PTEF1也在毕赤酵母中逐渐得到应用.Resina等[8]利用PFLD1在毕赤酵母中成功表达了米根霉脂肪酶，Ahn等[9]利用PTEF1在毕赤酵母中成功表达了嗜热芽孢杆菌脂肪酶，暴立娟等[10]更换pPIC9上的PAOX1为PGAP表达了木聚糖酶，最高酶活力达到98 U/mL.

本实验室前期获得了2种耐热半纤维素酶：甘露聚糖酶ManB和木聚糖酶DSB[11,12]，最适反应温度均在70 ℃以上，具有很好的工业应用前景.为提高2种半纤维素酶在毕赤酵母中的胞外酶活，且避免以甲醇作为碳源，本研究选择PFLD,PGAP,PTEF13个调控蛋白表达能力较强的启动子，分别表达了2种半纤维素酶，并与PAOX1比较，选择了适合2种半纤维素酶高效表达的启动子.

1 材料与方法

1.1 菌种与质粒

大肠杆菌(Escherichiacoli)Top 10菌株由本实验室保藏，含2种半纤维素酶基因的质粒pPIC9K-DSB和pPIC9K-ManB由本室保藏，毕赤酵母(Pichiapastoris) GS115和表达载体pPIC9K为中国农业科学院饲料研究所惠赠.

1.2 工具酶及试剂

限制性内切酶、PrimeSTAR Max DNA聚合酶、T4 DNA连接酶等工具酶、DNA Marker、蛋白质分子量 Marker(TaKaRa)；质粒DNA小量试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒、PCR清洁试剂盒(上海AxyPrep)；底物角豆胶、燕麦木聚糖(Sigma);蛋白胨、酵母提取液(Oxoid);无氨基酵母氮源(YNB)、D-山梨醇、琼脂、氨苄青霉素(Biosharp)；引物合成和重组质粒测序(武汉擎科创新生物科技)；其他试剂均为国产或进口分析纯.

1.3 培养基

毕赤酵母组氨酸缺陷型选择培养MD、毕赤酵母生长/诱导培养基BMGY/BMMY、大肠杆菌生长培养基LB、毕赤酵母生长培养基YPD等培养基配方见Invitrogen公司毕赤酵母操作手册.

1.4 不同启动子序列的克隆及表达载体的构建

利用重叠延伸PCR将pPIC9K中的PAOX1启动子分别替换成PFLD1,PTEF1和PGAP.扩增启动子所需引物(见表1).胶回收PCR产物，PFLD1经AatII和SnaB I双酶切，PTEF1和PGAP经AatII和EcoR I双酶切后，连接到经同样双酶切的载体pPIC9K上，获得含不同启动子的表达载体.再将含2种半纤维素酶基因的质粒pPIC9K-DSB和pPIC9K-ManB与上述构建的含不同启动子的质粒同时用EcoR I/NotI和SnaB I/NotI进行双酶切，分别连接获得基于不同启动子的2种半纤维素酶的表达载体pFLD1-DSB,pTEF1-DSB,pGAP-DSB,pFLD1-ManB和pGAP-ManB.

1.5 重组毕赤酵母的构建和筛选

以SalI线性化重组质粒pFLD1-DSB,pTEF1-DSB,pGAP-DSB和pPIC9K-DSB；以BspE I线性化重组质粒pFLD1-ManB,pGAP-ManB和pPIC9K-ManB.之后采用电转化法转化宿主菌P.pastorisGS115，于MD平板上涂板，于30 ℃倒置培养约48～72 h，菌落PCR筛选阳性转化子[13]，构建得到基于不同启动子的DSB和ManB分泌表达的重组酵母GS115/pFLD1-DSB,GS115/pTEF1-DSB,GS115/pGAP-DSB,GS115/pPIC9K-DSB,GS115/pFLD1-ManB,GS115/pGAP-ManB和GS115/pPIC9K- ManB.

1.6 重组菌的摇瓶发酵及酶活力测定

为比较PFLD1,PTEF1,PGAP和PAOX1这4种启动子表达2种半纤维素酶的能力，将筛选得到重组菌进行摇瓶发酵.其中PAOX1和PFLD1是诱导型启动子，PTEF1和PGAP是组成型启动子，将GS115/pFLD1-DSB,GS115/pFLD1-ManB,GS115/pPIC9K-DSB,GS115/pPIC9K-ManB接种至25 mL BMGY培养基的三角瓶中，将GS115/pTEF1-DSB,GS115/pGAP-DSB和GS115/pGAP-ManB接种至25 mLYPD培养基的三角瓶中，于30 ℃、250 r/min培养至OD600达到2～6.测定各重组菌的OD600值监测其生长情况，取适量菌悬液离心收集菌体，诱导型重组菌细胞沉淀转移至装液量为25 mL BMMY培养基的三角瓶中，组成型重组菌细胞沉淀转移至装液量为25 mL YPD培养基的三角瓶中，控制各重组菌起始OD600值为1，于30 ℃、250 r/min培养至120 h，诱导型重组菌每隔24 h添加适量的甲醇至终浓度为1%.各重组菌在诱导表达的过程中每隔24 h取0.25 mL样品测定OD600，监测其生长状况，并使用DNS法分别测定上清液和胞内的木聚糖酶和甘露聚糖酶的酶活力.所有实验数据均重复3次，并以GS115为阴性对照.

表1 用于不同启动子PCR扩增的引物序列Tab.1 Sequence of PCR amplification primers for different promoters

注：表示酶切位点

1.7 SDS-PAGE电泳分析

参考文献[14]，摇瓶发酵结束后，取等体积各重组菌的上清液及胞内溶液进行SDS-PAGE电泳分析.

2 结果与讨论

2.1 不同启动子基因片段的获得

利用重叠延伸PCR获得不同启动子基因片段的过程如图1所示，第三步PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测PFLD1,PTEF1和PGAP的大小分别约为1000,850,900 bp(见图2)，与预期大小一致.

图1 不同启动子基因片段获得示意图Fig.1 Schematic illustration of different promoter gene fragments

2.2 含不同启动子的DSB和ManB表达载体的构建

将回收后的各启动子PCR产物连接到pPIC9K载体上，替换原载体上的PAOX1启动子获得含不同启动子的表达质粒(见图3).再将DSB和ManB基因片段(大小分别为585,906 bp，见图4)插入到上述含不同启动子的表达载体的多克隆位点处获得基于不同启动子的DSB和ManB表达载体，测序结果验证以上5个重组质粒构建成功.

M) DL2000 DNA Marker; 1) PFLD1; 2) PGAP; 3)PTEF1图2 不同启动子基因片段PCR产物凝胶电泳Fig.2 Gel electrophoresis of different promoter gene fragments

图3 含不同启动子的DSB和ManB表达载体的构建示意图Fig.3 Schematic illustration of recombinant plasmids with DSB and ManB based on different promoter

M) DL15000 DNA Marker; 1) ManB; 2) DSB图4 DSB和ManB基因片段的凝胶电泳图Fig.4 Gel electrophoresis of DSB and ManB gene fragment

2.3 不同启动子对木聚糖酶DSB表达水平的影响

对GS115/pFLD1-DSB、GS115/pPIC9K-DSB、GS115/

pGAP-DSB和GS115/pTEF1-DSB进行摇瓶发酵产酶比较分析，各重组菌生长曲线和DSB酶活力曲线见图5. 由图5可见：启动子为诱导型的PAOX1和PFLD1的重组菌在甲醇培养基中发酵到96 h后菌体浓度和酶活力增长变慢，发酵到120 h时上清液酶活力分别为846,512 U/mL，此时的OD600分别为53和52. 而启动子为组成型的PGAP和PTEF1的重组菌前24 h生长非常迅速，之后OD600在43附近波动，且在整个发酵过程中上清液酶活力的变化幅度不大，最高酶活力分别为167,190 U/mL.

图5 不同启动子调控的DSB重组酵母的生长曲线(a)和发酵上清液的酶活曲线(b)Fig.5 Growth curve(a) and enzyme activity curve(b) of fermented supernatant of recombinants for expression of DSB with different promoter

当各重组菌发酵至120 h时，取相同体积的发酵上清液进行SDS-PAGE分析，结果见图6.

1) GS115/pPIC9K-ManB; 2) GS115/pFLD1-ManB; 3) GS115/pGAP-ManB;M) Premixed protein marker(broad); 4) GS115/pPIC9K -DSB; 5) GS115/pFLD1-DSB; 6) GS115/pGAP-DSB;7) GS115/pTEF1-DSB; 8) GS115 in BMMY; 9) GS115 in YPD图6 各重组菌发酵上清液(a)和胞内溶液(b)的SDS-PAGE电泳图Fig.6 SDS-PAGE analysis of supernatant (a) and intracellular sample(b) of the recombinant bacteria fermentation

如图6所示：DSB大小为23 KDa，且各重组菌上清液中蛋白含量与酶活测定结果一致，说明含组成型启动子的重组酵母酶活达到最大值的时间比含诱导型启动子的重组酵母短很多，但对于木聚糖酶DSB来说，在毕赤酵母GS115中分泌表达时PAOX1的调控效果最好.

2.4 不同启动子对甘露聚糖酶ManB表达水平的影响

对GS115/pFLD1-ManB,GS115/pPIC9K-ManB和GS115/pGAP-ManB进行摇瓶发酵产酶比较分析，各重组菌生长曲线和产ManB酶活曲线如图7所示. 由图7可见：含有诱导型启动子重组菌GS115/pPIC9K-ManB和GS115/pFLD1-ManB的OD600值和发酵上清液ManB酶活均随着时间的增加而增加，96 h之后增长变缓，发酵至120 h时最高酶活分别达到222,188 U/mL. 而含有组成型启动子PGAP的重组菌GS115/pGAP-ManB在培养24 h后OD600达45，随后维持稳定，其上清液酶活力在整个发酵过程中变化幅度也不大，最大值为27.3 U/mL. 结合各重组菌的发酵上清液的SDS-PAGE分析结果ManB大小为34 KDa，且各重组菌上清液中蛋白含量与酶活测定结果一致.说明含组成型启动子的重组酵母酶活达到最大值的时间比含诱导型启动子的重组酵母短很多.而对于甘露聚糖酶ManB来说，在毕赤酵母GS115中分泌表达时，使用诱导型启动子PFLD1调控时酶活力最高.

图7 不同启动子调控的ManB重组酵母的生长曲线(a)和发酵上清液(b)的酶活曲线Fig.7 Growth curve(a) and enzyme activity curve(b) of fermented supernatant(b) of recombinants for expression of ManB with different promoter

2.5 各重组菌DSB或ManB胞内滞留情况的分析

为分析不同启动子调控下DSB或ManB分泌表达时胞内滞留情况，发酵结束后取等量细胞进行破碎，对胞内溶液的酶活测定结果见图8. 结合SDS-PAGE电泳结果可知：无论使用何种启动子，DSB或ManB在重组菌胞内均有一定的滞留，但诱导型启动子重组菌胞内滞留量明显高于组成型启动子，而含PAOX1的重组菌胞内滞留量又明显高于含PFLD1的重组菌.胞内滞留酶活最高的是GS115/pPIC9K-ManB，达到52 U/mL.说明表达不同的外源蛋白时，应选择合适的启动子以减少外源蛋白在胞内的滞留，在一定程度上提高外源蛋白的分泌量.

图8 不同启动子调控的ManB和DSB胞内酶活Fig.8 DSB and ManB intracellular enzyme activity of recombinants with different promoter

3 讨论

使用高效的启动子是提高毕赤酵母外源蛋白表达和节约生产成本的有效途径之一.半纤维素酶广泛存在于自然界中，木聚糖酶和甘露聚糖酶作为其最主要的组成部分，在饲料、食品和造纸等工业领域中应用广泛，提高半纤维素酶的表达量可有效地降低工业生产成本.本研究前期获得了2个耐热半纤维素酶，耐热木聚糖酶DSB和耐热甘露聚糖酶ManB(最适反应温度分别为75 ℃和70 ℃)，具有较好的工业应用前景.

调控表达外源蛋白时，不同启动子的调控能力相差较大，目前很多学者致力于寻找不同的启动子来替换PAOX1，安全高效地提高外源蛋白表达量.张轩薇等[15]利用启动子PGCW14,PTEF,PGAP和PAOX1摇瓶发酵南极假丝酵母脂肪酶(CALB)的酶活力分别为649.8，499.2，266.7，684.3 U/g；对于CALB的表达，PAOX1与PGCW14的调控效果相当.战荣荣等[16]利用PFLD，PGAP和PAOX1调控菊糖果糖转移酶在毕赤酵母中的表达，最高酶活分别为6.5，5.3和11.9 U/mL，PAOX1的调控效果最好.本研究选择PFLD,PGAP和PTEF13个调控蛋白表达能力较强的启动子，分别分泌表达DSB和ManB，并与PAOX1进行比较.摇瓶发酵的结果显示：对于DSB，使用PAOX1时酶活力明显高于其他启动子，最高酶活达846 U/mL；对于ManB，使用PFLD1时酶活力略高于PAOX1，但明显高于PGAP，最高酶活达222 U/mL.在外源蛋白表达时，寻找合适的启动子是提高外源蛋白表达量的重要手段之一，因此在毕赤酵母GS115中表达DSB时应选用PAOX1，而表达ManB时应选用PFLD1.

为了进一步提高两种半纤维素酶的分泌表达效率，后续研究可对PFLD1,PTEF和PGAP进行改造，使其在毕赤酵母表达系统中更好地发挥功能，为高效而安全地表达半纤维素酶奠定基础，使毕赤酵母表达出的半纤维素酶可应用于食品、医药等更广阔的领域中.