蜡样芽孢杆菌CP-1对Cr(VI)还原效果研究

杨文玲, 刘丽, 巩涛, 赵俊杰, 李冠杰, 杜志敏, 刘莹莹, 孙晨阳, 陈国参



蜡样芽孢杆菌CP-1对Cr(VI)还原效果研究

杨文玲, 刘丽, 巩涛, 赵俊杰, 李冠杰, 杜志敏*, 刘莹莹, 孙晨阳, 陈国参

河南省科学院生物研究所有限责任公司, 郑州 450008

为了提高蜡样芽孢杆菌CP-1菌株对Cr(VI)的还原效果, 采用单因素和正交试验, 通过摇瓶发酵培养, 对影响蜡样芽孢杆菌CP-1菌株还原Cr(VI)的发酵培养基成分和培养条件进行了优化, 并研究了最佳发酵条件下的蜡样芽孢杆菌CP-1对Cr(VI)的还原效果。结果表明, 蜡样芽孢杆菌CP-1菌株还原Cr(VI)的最佳培养基组成为: 1%甘露醇, 3%的大豆蛋白胨, 0.05% KCl, 0.1% CuSO4, 在此基础上的最佳培养条件为: pH7.0、6%接种量、45℃培养3 d, 在此条件下, Cr(VI)初始浓度为100 mg·L-1时, 对Cr(VI)的还原率达99.75%。在Cr(VI)污染的土壤中添加蜡样芽孢杆菌CP-1 90 d后, 土壤中的Cr(VI)含量降低55.15%左右。

蜡样芽孢杆菌; Cr(VI); 培养条件; 还原效果

铬是毒性极强的重金属之一, 被列为对人体危害最大的八种化学物质之一, 是国际公认的三种致癌金属物之一, 严重危害生态环境和人类健康。自然界中的铬主要以三价或六价化合物的形式存在, 其中, Cr(VI)具有很高的毒性, 其化学活性大, 是造成土壤及其地下水污染的主要污染物, 而且其易进入人体细胞, 对肝、肾等内脏器官和DNA造成损伤[1-2]。目前, 常用的铬污染处理方法多为物理化学方法, 这些方法都会不同程度地产生二次污染, 而且处理过程成本相对较高, 操作复杂[3]。微生物修复是一种低能耗、高效率和对环境友好的环境生物技术, 目前也是Cr(VI)污染修复研究的热点。微生物作用土壤中Cr(VI)有2种方法: 吸附法和还原法。目前已分离出多种对Cr(VI)有还原作用的菌种, 如[4-5]、[6]、[7]、[8]、[9]、[9]、Arthrobacter[10]、[11]、[12]等等, 多种对Cr(VI)有吸附作用的菌种, 如[13]、[14]、[15]等。大多数Cr(VI)污染修复的研究还是集中在挖掘把Cr(VI)还原为毒性小、移动性弱的Cr(Ⅲ) 微生物上, 而微生物作用Cr(VI)的关键是从环境中筛选出高效的抗Cr(VI)的微生物资源。为了拓展重金属铬污染的治理技术, 本实验室从被铬污染的土壤中筛选出一株耐Cr(VI)浓度较高的细菌菌株CP-1, 经鉴定为蜡样芽孢杆菌(), 该菌为革兰氏阳性菌, 好氧, 菌落圆形, 表面湿润有光泽, 能产生过氧化氢酶, 能利用葡萄糖和麦芽糖发酵, 可水解明胶, 能利用柠檬酸盐。本研究通过对蜡样芽孢杆菌CP-1菌株还原Cr(VI)的发酵培养基成分和培养条件进行优化, 以期获得该菌株还原Cr(VI)的最佳条件, 并对其还原Cr(VI)的效果进行了研究, 以期为生物修复Cr(VI)污染土壤的实际应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试菌株与试剂

蜡样芽孢杆菌CP-1菌株为本实验室筛选保藏菌株, 其余所有试剂购自上海国药集团化学试剂公司。

1.2 培养基

LB液体培养基: 蛋白胨10 g·L-1, 酵母提取物5 g·L-1, 氯化钠10 g·L-1, pH7.2—7.4。

基础发酵培养基: 葡萄糖5 g·L-1, 蛋白胨5 g·L-1, MgSO4·7 H2O 0.5 g·L-1, pH7.0—7.5。

1.3 实验方法

(1) 种子培养将保存的蜡样芽孢杆菌CP-1菌液接入装有100 mL LB液体培养基的250 mL三角瓶中, 37℃, 160 r·min-1摇床震荡过夜培养, 备用。

(2) 单因素试验

碳源影响试验: 分别以葡萄糖、蔗糖、乳糖、甘露醇、可溶性淀粉、麸皮、玉米粉代替基础发酵培养基的葡萄糖作为碳源, 基础发酵培养基中其他成分不变, 250 mL摇瓶, 装液量100 mL, 加入10 g·L-1的Cr(VI)标准溶液使得Cr(VI)的终浓度为100 mg·L-1, 接种量4%(v:v), 37℃, 160 r·min-1摇床震荡培养48 h, 检测蜡样芽孢杆菌CP-1菌株还原 Cr(VI)的效果。

氮源影响试验: 分别以尿素、硫酸铵、蛋白胨、牛肉浸膏、大豆蛋白胨代替基础发酵培养基的蛋白胨作为氮源, 基础发酵培养基中其他成分不变, 250 mL摇瓶, 装液量100 mL, 加入10 g·L-1的Cr(VI)标准溶液使得 Cr(VI)的终浓度为100 mg·L-1, 接种量4%(v:v), 37℃, 160 r·min-1摇床震荡培养48 h,检测蜡样芽孢杆菌CP-1菌株还原 Cr(VI)的效果。

无机盐影响试验: 分别用FeSO4·5H2O、MnSO4·H2O、MgSO4·7H2O、CuSO4·5H2O、CaCl2·2H2O、KCl、NaCl等7种无机盐代替基础发酵培养基中的MgSO4·7H2O作为无机盐, 基础发酵培养基中其他成分不变, 250 mL摇瓶, 装液量100 mL, 加入10 g·L-1的Cr(VI)标准溶液使得Cr(VI)的终浓度为100 mg·L-1, 接种量4%(v:v), 37℃, 160 r·min-1摇床震荡培养48 h, 检测蜡样芽孢杆菌CP-1菌株还原 Cr(VI)的效果。

(3) 正交试验

根据单因素试验的结果, 将最佳碳源、氮源及无机盐按不同浓度进行正交试验, 进而研究碳源、氮源及无机盐的浓度对蜡样芽孢杆菌CP-1菌株还原Cr(VI)效果的影响。利用正交试验得到的最佳培养基, 研究不同pH、温度、培养时间、接种量对蜡样芽孢杆菌CP-1菌株还原Cr(VI)的效果的影响。

(4) 蜡样芽孢杆菌CP-1对Cr(VI)还原效果研究

将培养的蜡样芽孢杆菌CP-1种子液接于上述正交试验获得的最佳培养基中, 在最佳条件下培养制成菌悬液(活菌数为107cfu·mL-1), 用灭过菌的草炭按m(草炭):v(菌悬液)=1 g:1 mL吸附, 自然风干后备用。

试验所用草炭理化性质为: pH5.02、有机质含量44.0%、有机碳含量为25.5%, 全氮1.6 %、碱解氮1246.8 mg·kg-1、速效磷35.0 mg·kg-1、速效钾112.4 mg·kg-1。使用前将其捣碎, 过10目筛。

采用盆栽试验, 将重金属溶液与过筛的风干土混合, 制备成含一定浓度Cr(VI)(105.6 mg·kg-1)的污染土, Cr(VI)用K2Cr2O7配置, 充分混匀后, 分别加入1 g、2.5 g、5 g、7.5 g、10 g草炭吸附的蜡样芽孢杆菌CP-1, 空白对照加入灭菌的草炭, 混匀后每盆浇100 mL水, 分别于处理后15 d、30 d、90 d取土样, 测定土壤中的Cr(VI)含量, 考察蜡样芽孢杆菌CP-1对Cr(VI)污染土壤的还原效果。

1.4 溶液中Cr(VI)的测定采用二苯碳酰二肼分光光度法[16], 土壤中Cr(VI)的分析方法参照《固体废物铬(VI)的测定二苯碳酰二肼分光光度法》(GB/T 15555.4—1995)。

2 结果与分析

2.1 (1)碳源筛选

分别选用7种不同的碳源, 由图1可以看出, 当以甘露醇作为唯一碳源时, 48 h溶液中的Cr(VI)浓度最低, 此时, CP-1菌株对Cr(VI) 的还原率达43.01%, 其次是乳糖, 蔗糖效果最差, 表明甘露醇是该菌株还原Cr(VI)的最佳碳源。

(2) 氮源筛选

分别选用5种不同的氮源, 由图2可以看出, 以大豆蛋白胨、牛肉膏和尿素为氮源时, 溶液中Cr(VI)浓度相差不大, 其中以大豆蛋白胨作为唯一氮源时溶液中Cr(VI)浓度最低, 为61.92 mg·L-1。

(3) 无机盐筛选

分别选用7种不同的无机盐, 由图3可以看出, CuSO4作为唯一无机盐时溶液中Cr(VI)浓度最低, 为42.74 mg·L-1, 其次是KCl, 其他几种无机盐对还原Cr(VI)的效果差别不大。

(4) 正交试验

经过单因素影响试验条件优化后, 为了综合分析各因素对该菌株对Cr(VI)还原效果的影响, 从单因素试验结果中选出的最佳单因素条件, 进行了培养基主要成分的浓度正交试验。由表1可知, 菌株还原 Cr(VI)效果的影响因素为B>D>C>A, 即氮源>无机盐>碳源, 以氮源影响最为显著, 最佳组合为A2B3C1D2, 即该菌株还原Cr(VI)的最佳培养基为: 1%甘露醇, 3%的大豆蛋白胨, 0.05% KCl, 0.1% CuSO4。

注: 不同字母表示处理间差异显著(P<0.05)

Figure 1 Effect of different carbon sources on Cr(VI) reduction byCP-1 strain

注: 不同字母表示处理间差异显著(P<0.05)

Figure 2 Effect of different nitrogen sources on Cr(VI) reduction byCP-1 strain

注: 不同字母表示处理间差异显著(P<0.05)

Figure 3 Effect of different inorganic salts on Cr(VI) reduction byCP-1 strain

2.2 培养条件优化

把上述正交试验结果得到的最佳培养基作为研究培养条件的基础培养基, 在此基础上研究不同培养条件对蜡样芽孢杆菌CP-1还原Cr(VI)的影响。

(1) pH对蜡样芽孢杆菌CP-1菌株还原Cr(VI)能力的影响

将含100 mg·L-1Cr(VI)溶液用1 mol·L-1盐酸和5 mol·L-1氢氧化钠溶液调节pH为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0, 将CP-1种子液以4%的接种量分别接种于上述不同pH的最佳培养基中, 同时设不接菌的为空白对照组, 30℃, 160 r·min-1摇床培养2 d后, 取样检测其对 Cr(VI)的还原效果。由图4可以看出, 在较大的pH范围内, 该菌株都能有效地还原Cr(VI), 在pH为7.0的时候, 还原率最高, 此时溶液中剩余Cr(VI)浓度为10.25 mg·L-1。说明该菌株对pH的变化有较强的适应能力, 在pH值为7.0左右的环境下, 还原效果最好。

表1 培养基正交实验结果

注: 数据表示平均值±标准差。同一列中字母不同表示有显著性差异(P<0.05)

(2) 接种量对蜡样芽孢杆菌CP-1菌株还原Cr(VI)能力的影响

在上述最佳pH下, 将CP-1菌株种子液分别以1%、2%、4%、6%的接种量接种于含100 mg·L-1Cr(VI)的最佳培养基中, 同时设不接菌的为空白对照组, 30℃, 160 r·min-1摇床培养2 d后, 取样检测其对 Cr(VI)的还原效果。结果如图5所示, 当接种量在2%以上时, 随着接种量的增加, Cr(VI)的浓度不断降低, 在6%的接种量条件下, 菌株的还原效果最好, 溶液中剩余Cr(VI)浓度为20.14 mg·L-1, 还原率达79.86%, 因此, 该菌株还原Cr(VI)的最佳接种量为6%。

注: 不同字母表示处理间差异显著(P<0.05)

Figure 4 Effect of pH on the Cr(VI) reduction ability byCP-1 strain

(3) 温度对蜡样芽孢杆菌CP-1菌株还原Cr(VI)能力的影响

在上述最佳pH和接种量下, 将CP-1种子液接种于含100 mg·L-1Cr(VI)的最佳培养基中, 同时设不接菌的为空白对照组, 分别于25℃、30℃、35℃、40℃、45℃, 160 r·min-1摇床培养2 d后, 取样检测其对 Cr(VI)的还原效果, 结果如图6所示, 1 d后, 溶液中Cr(VI)分别减少到72.80、68.24、63.77, 37.83、32.64 mg·L-1, 说明随着温度的增高, Cr(VI)的浓度不断降低, 在45℃的时候, 还原效果最好, 还原率达到67.36%, 因此, 蜡样芽孢杆菌还原Cr(VI)的最佳温度是45℃。

(4) 培养时间对蜡样芽孢杆菌CP-1菌株还原Cr(VI)能力的影响

在上述最佳pH、接种量和温度条件下, 将CP-1种子液接种于含100 mg·L-1Cr(VI)的最佳培养基中, 同时设不接菌的为空白对照组, 160 r·min-1摇床分别培养1 d、2 d、3 d后, 取样检测其对Cr(VI)的还原效果, 结果如图7所示, 可以看出, 随着培养时间的增加, 菌株还原Cr(VI)的效果有显著的提升, 在培养到第3 d的时候, 溶液中剩余的Cr(VI)的浓度仅有0.25 mg·L-1, 还原率达到99.75%。因此, 蜡样芽孢杆菌还原Cr(VI)的最佳培养时间为3 d。

注: 不同字母表示处理间差异显著(P<0.05)

Figure 5 Effect of inoculation amount on the Cr(VI) reduction ability byCP-1 strain

本试验结果显示, 蜡样芽孢杆菌除Cr(VI)的最佳条件为pH7.0、6%接种量、45℃培养3 d。在此条件下, 对Cr(VI)的还原率达99.75%。

2.3 蜡样芽孢杆菌CP-1对Cr(VI)还原效果研究

添加CP-1 15 d后, 土壤中的Cr(VI)含量与不加CP-1的对照相比均有所降低(见图8), 其中以7.5 g和10 g CP-1添加剂量组降低最为明显, 较对照分别降低39.38%, 36.66%。

注: 不同字母表示处理间差异显著(P<0.05)

Figure 6 Effect of culture temperature on the Cr(VI) reduction ability byCP-1 strain

注: 不同字母表示处理间差异显著(P<0.05)

Figure 7 Effect of culture time on the Cr(VI) reduction ability byCP-1 strain

注: 不同字母表示处理间差异显著(P<0.05)

Figure 8 Effect of different dosages ofCP-1 on Cr(VI) content in soil for 15 d

添加CP-1 30 d后, 各处理土壤中的Cr(VI)含量继续减少, 仍然以7.5 g和10 g CP-1添加剂量组降低最为明显, 与不加CP-1的对照相比差异达显著水平, 二者之间Cr(VI)含量无显著差异。

添加CP-1 90 d后, 各处理土壤中的Cr(VI)含量继续减少, 7.5 g和10 g CP-1添加剂量组效果依然是最好的, 此时, 土壤中的Cr(VI)含量较不加CP-1的对照分别降低55.15%, 38.22%, 7.5 g和10 g CP-1添加剂量组与对照和1 g CP-1添加剂量组的差异均达显著水平, 二者之间Cr(VI)含量无显著差异。

3 讨论

本研究结果显示, 该蜡样芽孢杆菌CP-1还原 Cr(VI)的最佳培养基为: 1%甘露醇, 3%的大豆蛋白胨, 0.05% KCl, 0.1% CuSO4, 而黄世臣等[17]分离筛选的菌株在以可溶性淀粉为碳源、硫酸铵为氮源时去除Cr(VI)效果最好; 焦仕林等[5]获得的高效还原Cr(VI)的蜡样芽孢杆菌Cr4-1菌株和Zhou等[18]获得的spS2菌株还原 Cr(VI)的较好碳源均是乳酸钠。可见, 由于环境因素的差异, 筛选出的Cr(VI)抗性菌株的类别、作用Cr(VI)的机制、影响其作用Cr(VI)效果的因素也千差万别。

注: 不同字母表示处理间差异显著(P<0.05)

Figure 9 Effect of different dosages ofCP-1 on Cr(VI) content in soil for 30 d

注: 不同字母表示处理间差异显著(P<0.05)

Figure 10 Effect of different dosages ofCP-1 on Cr(VI) content in soil for 90 d

温度是微生物作用Cr(VI)的很重要的环境因素, 不同的微生物菌株作用Cr(VI)的最适温度有所不同。本试验结果显示, 随着温度的增高, Cr(VI)的浓度不断降低, 在45℃的时候, 还原效果最好, 而He等[8]发现了1株属的CSCr-3菌株还原Cr(VI)的最适温度为35℃,strain CRB5菌株还原Cr(VI)的最适温度为30℃[19]。黄世臣等[17]研究发现pH值和温度是影响菌株去除铬的主要因素, 当pH值和温度过高或过低时, 菌体生长代谢受到抑制, 生物降解能力下降从而导致对水环境中铬离子的去除率明显下降。本研究通过4因素3水平正交试验设计, 探讨蜡样芽孢杆菌CP-1菌株还原Cr(VI)的影响因素, 结果显示, 在较宽泛的pH范围内(5.0—8.0), 蜡样芽孢杆菌CP-1菌株对Cr(VI)的还原效果都很好, 可见, 该菌株对pH的变化有很强的适应能力; Cr(VI)初始浓度为100 mg·L-1时, 该菌株对Cr(VI)的还原率均在50%以上, 尤其是在pH为7.0的时候, 还原率最高, 达89.75%。杨文玲等[20]发现中性或偏碱的环境比较适合蜡样芽孢杆菌Cr2菌株去除Cr(VI), Liu等[21]发现还原Cr(VI)的最适pH为7.0, 而Shakoori等[22]发现1株细菌在pH为9.0时, 还原Cr(VI)的效果最好。表明不同的菌株在作用Cr(VI)的过程中对pH的适应能力不同。

在长期存在重金属污染的土壤中, 某些微生物为了适应这种生存环境而形成了一些特殊的属性, 使其在那些被重金属污染的土壤治理方面具有特殊的作用。蜡样芽孢杆菌CP-1是从铬污染土壤中分离筛选出来的对Cr(VI)具有还原作用的菌株, 它能将高毒性的Cr(VI)还原为低毒性的Cr(Ⅲ), 以降低铬的毒性和生物有效性, 从而实现铬污染土壤的修复。利用盆栽试验研究添加不同剂量的蜡样芽孢杆菌CP-1菌株对Cr(VI)的还原效果, 结果发现, 随着蜡样芽孢杆菌CP-1添加量的增加, 土壤中的Cr(VI)含量逐渐降低; 当蜡样芽孢杆菌CP-1添加量增加到2.5 g以上, 90 d后, 土壤中的Cr(VI)含量较不加CP-1的对照明显降低。说明添加合适剂量的蜡样芽孢杆菌CP-1有利于土壤中Cr(VI)的还原, 也说明蜡样芽孢杆菌CP-1是一种有效的抗重金属铬的微生物资源, 为进一步利用该菌株修复铬污染土壤的实际应用以及为微生物-植物联合修复重金属铬污染土壤的实际应用提供了参考依据。

4 结论

蜡样芽孢杆菌CP-1菌株对Cr(VI)有很好的还原效果, 其还原Cr(VI)的最佳培养基组成为: 1%甘露醇, 3%的大豆蛋白胨, 0.05% KCl, 0.1% CuSO4, 在此基础上的最佳培养条件为: pH7.0、6%接种量、45℃培养3 d, 在此条件下, Cr(VI)初始浓度为100 mg·L-1时, 对Cr(VI)的还原率达99.75%; 添加蜡样芽孢杆菌CP-1 90 d后, 土壤中的Cr(VI)含量较不加CP-1的对照降低55.15%左右。作为一种有效的抗重金属铬的微生物资源, 蜡样芽孢杆菌CP-1具有很好的应用前景。

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Study on Cr(VI) reduction byCP-1

YANG Wenling, LIU Li, GONG Tao, ZHAO Junjie, LI Guanjie, DU Zhimin*, LIU Yingying, SUN Chenyang, CHEN Guocan

Institute of Biology Co., Ltd, Henan Academy of Sciences, Henan, Zhengzhou 450008, China

In order to improve the Cr(VI) reduction byCP-1, single-factor and orthogonal experiments were used to study the effects of fermentation and culture conditions on Cr(VI) reduction, and the reduction effects ofCP-1 on Cr(VI) were evaluated under the optimal fermentation conditions. The results showed that the optimal medium for the Cr(VI) reduction byCP-1 was 1% mannitol, 3% soy peptone, 0.05% KCl and 0.1% CuSO4. The reduction rate of Cr(VI) was 99.75% based on the best culture condition of pH7, 6% inoculation amount and 45℃ for 3 d when the initial concentration of Cr(VI) was 100 mg·L-1. Specially, the Cr(VI) content in Cr(VI)-contaminated soil was decreased 55.15% after addingCP-1 for 90 d.

B; Cr(VI); culture condition; reduction effect

10.14108/j.cnki.1008-8873.2019.01.016

X53

A

1008-8873(2019)01-123-07

2018-01-05;

2018-03-28

河南省科技攻关项目(172102210326, 182102311013); 河南省基础与前沿技术研究计划项目(162300410174); 河南省科学院基本科研业务费项目(18JK16013,190605019)

杨文玲(1983—), 女, 河南郑州人, 博士, 助理研究员, 主要从事土壤重金属污染修复研究, E-mail: yangwenling2016@163.com

杜志敏(1985—), 女, 河南武陟人, 博士, 助理研究员, 主要从事土壤重金属污染修复研究, E-mail: duzhimin324@163.com

杨文玲, 刘丽, 巩涛, 等. 蜡样芽孢杆菌CP-1对Cr(VI)还原效果研究[J]. 生态科学, 2019, 38(1): 123-129.

YANG Wenling, LIU Li, GONG Tao, et al. Study on Cr(VI) reduction byCP-1[J]. Ecological Science, 2019, 38(1): 123-129.