基于高通量测序分析不同保鲜冰处理对鲈鱼菌群组成与代谢功能的影响

张皖君，蓝蔚青,2,*，段贤源，孙晓红,2，谢 晶,2,*

（1.上海海洋大学食品学院，上海 201306；2.上海水产品加工及贮藏工程技术研究中心，上海冷链装备性能与节能评价专业技术服务平台，食品科学与工程国家级实验教学示范中心（上海海洋大学），上海 201306）

鲈鱼（Lateolabrax japonicus）属鲈形目、鲈属经济鱼类，在我国海洋渔业中具有相当重要的地位，经济价值与开发潜力较高。近年来，随着鲈鱼市场需求的不断增长，开展鲈鱼的贮藏保鲜研究显得尤为重要。但由于鲈鱼水分与蛋白质含量高，鱼体鳃部及体表易携带大量细菌，贮藏期间极易腐败变质[1]。前人研究得出，微生物的生长繁殖会加速鱼肉组织结构分解、氧化酸败并产生大量异味，导致其腐败，严重影响水产品的品质[2-3]。目前普遍应用的保鲜方法是冰藏。传统碎冰（crushed ice，CI）贮藏密封不充分，抑菌效果差，保鲜能力不足；因此优化冰藏处理技术对延长水产品货架期具有重要意义[4]。流化冰（slurry ice，SI）为新型保鲜处理技术，其具有预冷速度快、机械损伤小等优点，贮藏中可将鱼体完全浸没，能有效隔绝氧气。同时，SI中的盐对细菌也有一定的抑制作用，能延缓由氧化和微生物繁殖导致的腐败变质[5]。酸性电解水冰（acidic electrolyzed water ice，AEWI）不仅结合了传统冰低温贮藏的作用，还具有杀菌能力强、应用范围广且安全方便的特点，在水产品保鲜中也有广泛应用[6]。但由于鱼类在冰藏过程中依然会受到优势腐败菌（specific spoilage organisms，SSO）的影响，且其生长速度和致腐能力均较强[7]；因此，开展水产品冰藏期间SSO的研究并进行靶向抑制，对水产品保鲜具有重要意义。

现有报道显示，目前微生物群落研究主要基于传统分离培养或变性梯度凝胶电泳（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）等分子生态学技术开展，其仅能检测极少数易培养或优势菌群的变化情况，难以反映微生物真实丰度与演替规律[8]。高通量测序技术也称“下一代测序”技术，能一次并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定，一般以读长较短为标志，是微生物领域中重要的研究方法，具有测序通量高、结果精准等优点[9-10]。其虽建立时间不长，但发展迅速，现已广泛应用于基因组，包括测序、表观基因组学与功能基因组学研究等方面[11]。高通量测序技术能检出样品中不可培养及低丰度的微生物，在土壤多样化、肠道环境、发酵食品与人类健康等学科领域应用广泛[12]。米其利等[13]对高通量测序技术的操作流程、在食品微生物生态学中的应用进行综述，评价了该测序技术的优势、局限性及应用前景。张和平等[14]总结了近年来高通量测序技术在乳制品微生物基因组和生物多样性中的应用现状。目前高通量技术在鲐鱼、大黄鱼、南美白对虾、鲊鱼等水产品的微生物生态学上已有应用研究，但运用高通量技术分析不同冰藏条件下鲈鱼中的细菌群落演变规律及品质特征变化的报道较少[15-17]。

本实验在进行挥发性盐基氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N）含量、K值等品质指标测定的基础上，通过Illumina Miseq测序平台和PICRUSt功能预测工具来对比分析不同冰藏条件下鲈鱼菌群结构和代谢功能的差异，以揭示鲈鱼冰藏过程中的微生物变化规律及致腐机制，为后期靶向抑制其腐败变质提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鲜活鲈鱼（质量（500±20）g、体长（27.5±1.2）cm），购自上海市水产品市场，30 min内运至实验室后立即处理。

细菌基因组DNA提取试剂盒（E.Z.N.A.Soil DNA Kit）美国OMEGA公司；Qubit 3.0 DNA检测试剂盒 美国Life公司；Taq酶 赛默飞世尔科技公司（上海）；核酸纯化试剂盒（Agencourt AMPure XP） Beckman公司（中国）；ATP关联物标准品 美国Sigma公司；轻质氯化镁等 国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

RE-1000W-SP型SI制冰机 江苏南通瑞友工贸有限公司；AF-103 AS型制冰机 意大利Scotsman公司；FW-200型强酸性电解水生成器 日本Amano公司；Kjeltec8400型凯氏定氮仪 丹麦FOSS公司；Alliance 2695型高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）系统 美国Waters公司；DYCZ-21型电泳槽 北京市六一仪器厂；T100TM型聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）仪 伯乐（中国）公司；Miseq高通量测序仪 美国Illumina公司。

1.3 方法

1.3.1 原料处理与分组

样品用冰水洗净后随机分为3 组，分别置于盛有SI、AEWI和CI的泡沫箱中，冰鱼体积比为1∶1，置于4 ℃冰箱冰藏，隔天换冰一次。鲈鱼经去头、尾、内脏，取背部鱼肉进行各项指标测定和细菌DNA提取。

选择3 个处理组样品分别于0～23 d内定期取样测定其TVB-N含量与K值，判定其鲜度变化，每个指标做3 组平行。同时，选取贮藏前期（3 d）、中期（12 d）与末期（21 d）的样品直接用于提取总细菌DNA。其中，贮藏3 d的SI、AEWI、CI组细菌基因组DNA分别记为A1、A2、A3，12 d和21 d的SI、AEWI、CI组细菌基因组DNA分别记为B1、B2、B3和C1、C2、C3。

1.3.2 保鲜冰制备

表 1 不同保鲜冰制取规格参数Table 1 Preparation methods and technical parameters for different types of ice used for fi sh preservation

1.3.3 TVB-N含量的测定

参考SC/T 3032—2007《水产品中挥发性盐基氮的测定》[18]进行操作，平行测定3 次，结果以mg/100 g表示。

1.3.4 K值的测定

参考杨文鸽等[19]的方法，并略作改动。取5 g鱼样放入离心管，加入质量分数10%高氯酸10 mL，匀浆后8 000 r/min冷冻离心15 min，取上清液。沉淀用10 mL 5%高氯酸洗涤，冷冻离心取上清液，合并上清液，用KOH溶液调pH值至6.5，取上清液于50 mL容量瓶中定容，过0.22 μm膜后液相测定。HPLC检验条件：pH 6.5的0.05 mol/L磷酸缓冲溶液平衡洗脱；进样量10 μL，流速1 mL/min，柱温28 ℃，检测波长254 nm，采用外标法进行定量。计算方法如下式所示。

式中：ATP、ADP、AMP、IMP、HxR、Hx分别代表腺苷三磷酸、腺苷二磷酸、腺苷酸、肌苷酸、次黄嘌呤核苷、次黄嘌呤的含量/（μmol/g）。

1.3.5 总DNA提取与PCR扩增

在无菌状态下取不同部位的鲈鱼肉，混匀后称量，采用E.Z.N.A.Soil DNA Kit的试剂盒提取鲈鱼肉中总菌群的基因组DNA[2]。用琼脂糖凝胶检测DNA完整性，置于-20 ℃备用。PCR所需引物为已融合引物（Miseq测序平台中V3～V4通用的引物）341F（5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′）与805R（5′-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3′）。其中，两轮PCR扩增体系与扩增条件参照温崇庆等[20]的方法，第一轮，30 μL PCR反应体系：2×Taq master Mix 15 μL、10 μmol/L引物各1 μL、DNA模板10 ng，加ddH2O至30 μL。PCR扩增条件为：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，45 ℃退火20 s，65 ℃延伸30 s，5 个循环；94 ℃变性20 s，55 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，20 个循环；72 ℃延伸5 min。第二轮扩增，引入Illumina桥式PCR兼容引物，DNA模板为20 ng，PCR扩增条件为：95 ℃预变性30 s；95 ℃变性15 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s，5 个循环；72 ℃延伸5 min。第二轮PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，观察扩增效果。

1.3.6 PCR产物纯化及测序

使用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒对DNA进行回收，用Qubit 3.0 DNA检测试剂盒对回收的DNA精确定量，以便于后续实验按照体积比1∶1混合后测序。由生工生物工程（上海）股份有限公司进行Illumina MiSeq高通量测序。

1.3.7 QIIME软件数据分析

通过QIIME软件（生工生物工程（上海）股份有限公司）对获得的序列进行质控与过滤，舍弃低质量的DNA序列，对获得的高质量有效序列作分类单元（operational taxonomic units，OTU）聚类[21]。根据聚类分析结果，使用mothur软件（http∶//www.mothur.org/）中的summary.single命令，计算生物多样性指数并进行Alpha多样性分析，采用RDP-classifier（https∶//sourceforge.net/projects/rdp-classifier/）方法[22]和Green Gene数据库对序列进行物种注释和分类学分析。

由OTU的分析结果计算常用的Alpha多样性指数，其中，Coverage值为测序深度指数，代表每个样品文库的覆盖率；Chao1和ACE指数可表示菌群丰富程度，数值越高表明群落物种丰富度越高；香农和辛普森指数反映物种多样性，群落多样性与香农指数呈正相关，与辛普森指数呈负相关[21]。

稀释曲线可用来说明样本的测序数据量是否合理，利用mothur软件对OTU做Rarefaction分析，利用R软件绘制曲线图。主成分分析（principal component analysis，PCA）通过方差分解，对原有的复杂数据降维，保持数据集中对方差贡献最大的特征，反映样本间的差异和距离，利用R软件的vegan package进行分析[16]。利用PICRUSt（http∶//picrust.github.io/picrust/）工具将OTU表标准化并进行功能预测分析。

1.4 数据分析

利用Excel 2010、SPSS Statistics 20.0等统计软件进行数据处理和分析，利用Origin 9.1软件作图。

2 结果与分析

2.1 TVB-N含量和K值分析

鲈鱼肉的TVB-N含量小于13 mg/100 g为一级鲜度，TVB-N含量大于30 mg/100 g即不可食用[23]。

如图1所示，从6 d开始，CI组样品的TVB-N含量明显上升，在12 d时超过一级鲜度的极限值，贮藏18 d时已接近限量标准。SI组样品的TVB-N含量在18 d时处于一级鲜度，AEWI组样品也处于新鲜状态，贮藏后期SI组样品的TVB-N含量在初始值附近，明显低于AEWI组样品。一般认为作为生鱼片的新鲜鱼K值约在20%以下，20%～50%为二级鲜度，大于70%为不可食用[24]。鲈鱼样品的初始K值为（3.95±0.18）%，表明样品的新鲜度较高。在贮藏第21天，CI和AEWI处理组样品的K值分别达到（76.41±2.12）%、（75.95±2.01）%，SI组样品为（51.08±1.22）%，低于其余两组。因此，SI可抑制样品蛋白质和核苷酸的降解速度，其中AEWI组的保鲜效果优于CI组。

图 1 不同冰处理对鲈鱼贮藏过程中TVB-N含量（A）与K值（B）的影响Fig. 1 Effect of different ice treatments on TVB-N content (A) and K value (B) of Lateolab rax japonicas

2.2 样品细菌多样性分析

由表2可知，经质控与过滤等处理后得到了鲈鱼样品的有效序列，不同贮藏时间下每组样品的有效序列数均在10 000以上，有效序列达50%以上，表明测序所得到的有效序列可达到后续微生物多样性分析的要求[25]。对97%相似水平下的OTU进行生物信息统计，AEWI和CI组样品随着贮藏时间的延长，OTU数量明显增加，SI组鲈鱼样品OTU数量在贮藏后期较少，表明菌群种类较少。

表 2 不同冰藏条件下鲈鱼样品序列信息和Alpha多样性指数Table 2 Summary of the sequencing data sets and Alpha diversity index for Lateolabrax japonicas with different ice treatments

由表2可知，各样品的测序深度指数Coverage值均大于0.99，说明样品中序列未被测出的概率较低，测序结果可反映不同冰藏过程中鲈鱼样品的真实情况[26]。AEWI组中Chao1、Ace、香农指数最小的均为样品A2，数值最大的均是样品C2，这说明AEWI组中的鲈鱼样品在3 d时物种丰富度最低，在21 d时物种丰富度和微生物多样性达到最高，可能由于此时AEWI中的有效氯成分挥发，抑菌效果降低，导致微生物污染和繁殖加剧[27]。CI组在贮藏12 d物种丰富度和微生物多样性较高，说明微生物种类和含量迅速增加，鲈鱼样品在此时已腐败。SI组中A1样品的物种丰富度最高，可能由于贮藏前期SI中的微生物与鱼体发生交叉感染，导致微生物数量增加[28]。SI组样品中，C1的Ace、Chao1和香农指数最低，辛普森指数最高，表明SI贮藏末期样品菌群丰度及多样性较低，其原因可能是“微冻”温度抑制了部分微生物的生长与繁殖，使鲈鱼样品菌群结构发生较大变化[16]。

图 2 各样品稀释性曲线（A）和香农指数曲线（B）分析Fig. 2 Rarefaction curves (A) and Shannon index curves (B) for different samples

如图2A所示，随着测序量的增加，各组样品稀释性曲线逐渐进入饱和期，说明测序量合理充分，测序深度已基本覆盖所有物种信息[29]。同时，香农指数曲线也趋于平缓（图2B），表明测序数据可反映样品中微生物菌群多样性组成，更多数据量对发现新的OTU贡献很小。

2.3 不同冰处理对鲈鱼贮藏过程中细菌群落结构的影响

对所有冰藏样品获得的OTU从属水平上进行物种注释，图3为属水平上相对丰度大于1%的菌群柱状分布图。

图 3 不同冰藏条件下鲈鱼样品微生物物种组成Fig. 3 Bacterial community composition at the genus level in Lateolabrax japonicas with different ice treatments

由图3可知，鲈鱼在不同贮藏阶段中的菌群结构差异较大。在冰藏初期（3 d），3 组中鲈鱼样品A1、A2、A3主要以芽孢杆菌属（Bacillus）、乳球菌属（Lactococcus）、大洋芽孢杆菌属（Oceanobacillus）、肾杆菌属（R e n i b a c t e r i u m）、不动杆菌属（Acinetobacter）为主，其中在菌群中占比例最大的是芽孢杆菌属，分别达30.08%、38.12%、33.82%，与目前大多数冷鲜肉优势腐败菌研究结果[17,30]一致，其次为乳球菌属、大洋芽孢杆菌属。随着冰藏时间的延长，鲈鱼样品中芽孢杆菌属、乳球菌属和大洋芽孢杆菌属相对丰度明显下降，且以上菌属在AEWI组和CI组的相对丰度显著高于SI组。

随着贮藏时间的延长，SI处理样品中的假单胞菌属（Pseudomonas）、希瓦氏菌属（Shewanella）相对丰度分别由1.25%、0.03%升至4.38%、4.06%，摩替亚氏菌属（Moritella）、埃希氏杆菌属（Escherichia）和别弧菌属（Aliivibrio）在贮藏中、后期所占比例逐渐增大，优势明显。相关研究报道显示，假单胞菌属和希瓦氏菌属是水产品低温贮藏过程中常见的腐败菌，具有很强的产生氨等腐败产物的能力[31-32]。此外，摩替亚氏菌属、埃希氏杆菌属也能在冰藏温度下生长，是冷鲜水产品和禽畜肉中的常见腐败菌和致病菌[33]。在AEWI和CI组样品中，假单胞菌属、短波单胞菌属（Brevundimonas）与不动杆菌属（Acinetobacter）在贮藏前期均未检出或检出量很少，到12 d时，其所占比例总体呈增长态势，21 d时AEWI组假单胞菌属和不动杆菌属迅速增加，加速了冰鲜鲈鱼的腐败。CI组在21 d时不动杆菌属比例达27.77%，说明该菌是影响CI组贮藏过程中鲈鱼腐败变质的优势菌属。综上所述，假单胞菌属、不动杆菌属和希瓦氏菌属可能是鲈鱼冰藏期间的主要优势菌。

2.4 PCA比较分析

图 4 不同冰藏条件下鲈鱼样品PCA分析Fig. 4 Principal component analysis (PCA) of bacterial community composition in Lateolabrax japonicas with different ice treatments

样品在PCA图中相应坐标轴上的距离越近，组成相似性越高[25]。对于主成分PC1-2分析（图4A），冰藏前期的样品A1、A2、A3样品较为相近，说明在这一主成分水平上3 种保鲜冰处理下鲈鱼贮藏前期的菌群特征较为相近[12]。对主成分PC1-3分析（图4B），在主成分PC3方面，贮藏21 d的3 组鲈鱼样品与前、中期样品的距离区分度明显，表明样品在冰藏末期的菌群组成发生较大变化，该结果与群落结构分析结果一致。温冬玲等[25]在不同增菌温度下冷鲜鸡肉细菌群落的主成分分析中也得到相似结果。主成分PC2-3分析中（图4C），贮藏12 d的样品B1、B2、B3间与贮藏21 d的C1、C2、C3样品间在主成分PC2和PC3方面均距离相对较远，贮藏中期和末期样品在几种特定微生物组成上均有较大差异。总体来看，在各个主成分坐标轴上，贮藏末期3 个处理组样品与前、中期样品均相距较远，且贮藏末期的样品C2、C3与C1相互间也有一定距离，表明贮藏时间及冰藏方式对鲈鱼样品微生物种类及组成变化影响显著，导致冰鲜鲈鱼群落结构组成发生较大变化。

2.5 TVB-N含量、K值相关细菌筛选

表 3 鲈鱼冰藏期间与TVB-N含量、K值显著相关细菌Table 3 Bacteria at the genus level remarkably associated with TVB-N content and K value in Lateolabrax japonicas during ice storage

在属水平上，利用皮尔森相关性检验冰藏期间鲈鱼TVB-N含量、K值与微生物群落的相关性，筛选出相对丰度＞1%，r＞0.5且P＜0.05的相关细菌。结果如表3所示，鲈鱼样品中与TVB-N含量显著相关的细菌共4 个，其中与TVB-N含量呈正相关的有假单胞菌属、短波单胞菌属和不动杆菌属。与K值显著相关的细菌有8 个，其中呈正相关的主要是嗜冷杆菌属（Psychrobacter）、假单胞菌属和希瓦氏菌属，表明这些微生物可能是导致冰藏期间鲈鱼腐败变质的优势菌。

2.6 PICRUSt功能预测

利用软件PICRUSt进行功能基因的同源蛋白簇预测（相对丰度＞0.1%），在功能聚类上，鲈鱼样品细菌代谢相关基因能基本按不同贮藏时间聚成3 类（即前、中、后期），不同保鲜冰组之间有交叉，也有相似之处。杨娟等[34]在研究集雨窖水中微生物群落结构中也得到类似结果。结果获得预测功能基因中主要是氨基酸转运和代谢、碳水化合物转运和代谢、脂质转运和代谢、辅酶转运和代谢、能源产生和转换等与代谢相关的基因。此外，鲈鱼样品中还有与翻译、核糖体结构和起源，转录，复制、重组和修复，细胞壁/膜/包膜起源，无机离子运输和代谢以及信号转导机制等相关的功能基因。冰藏至21 d时，鲈鱼样品中与上述新陈代谢和能源生产与转换相关的基因在数量上呈C2＞C3＞C1的趋势。其中，有关氨基酸、碳水化合物和脂质代谢的基因在数量上，C3和C2显著高于C1。表明随着贮藏时间的延长，在相关微生物作用下，CI和AEWI的样品更易进行氨基酸、脂质和碳水化合物代谢产生醛、酮和酸等物质，使鱼体产生腥臭味，品质下降。说明PICRUSt功能预测在肌肉新陈代谢相关菌的研究上表现出良好的应用前景，能为从微生物代谢角度延缓鲈鱼腐败的研究提供新思路。

图 5 不同冷藏处理下鲈鱼样品细菌群落的代谢相关基因丰度分布热图Fig. 5 Heatmap of the abundance of genes related to bacterial community metabolism in Lateolabrax japonicas with different ice treatments

3 结 论

不同保鲜冰处理下鲈鱼微生物多样性存在较大差异，与SI组相比，AEWI和CI组抑菌效果降低，群落多样性与丰富度增加。冰藏前期，3 组鲈鱼样品中主要以芽孢杆菌属、乳球菌属、大洋芽孢杆菌属为主，其中AEWI组和CI组的相对丰度显著高于SI组，随贮藏时间延长，鲈鱼菌群组成发生变化，其优势菌可能为假单胞菌属、不动杆菌属、嗜冷杆菌属、希瓦氏菌属。PCA分析发现，贮藏末期3 组样品的微生物种类及组成与其他时期样品存在较大差异，且样品C2、C3与C1间也相距较远，表明贮藏时间与冰藏方式对鲈鱼群落结构有较大影响。与SI组相比，CI和AEWI组鲈鱼样品细菌具有更高丰度的参与氨基酸、脂质和碳水化合物代谢的相关基因，说明SI对鲈鱼腐败降解的抑制效果优于AEWI和CI。本研究为从微生物代谢功能角度开发针对性的鲈鱼保鲜技术提供了参考。