果实粒径对‘美乐’和‘蛇龙珠’葡萄果实品质的影响

乐小凤，唐永红，鞠延仑，郭水欢，赵亚蒙，惠竹梅,2，张振文,2,*

（1.西北农林科技大学葡萄酒学院，陕西 杨凌 712100；2.陕西省葡萄与葡萄酒工程技术研究中心，陕西 杨凌 712100）

果实生长过程中常会出现大小不一的现象，这在蜜桔[1]、桃[2]、荔枝[3]、苹果[4]和葡萄[5]等水果中已有报道。细胞数目、细胞大小和细胞间隙是影响果实大小的三要素，内源激素参与调节细胞分裂和膨大[3]。Cowan等[6]认为小果油梨是由于细胞分裂受到了限制；Moore-Gordon等[7]发现油梨果实大小与脱落酸含量呈负相关；也有研究表明生长素、赤霉素和细胞分裂素有利于形成大果荔枝[8]。

酿酒葡萄果实发育的不同步性会导致果实粒径不同[9]。葡萄果实粒径也会受激素调节、环境因素以及栽培管理方法等的影响，可以通过改变果皮、果肉和种子所占比例来影响葡萄和葡萄酒的品质[10]。葡萄授粉时间的不同会导致先授粉的果粒先膨大，由于具有充足的营养而形成大果粒；后期授粉的果粒膨大时因营养不足而形成小果粒；在葡萄花期之前和坐果期，若前期供水量偏大或者氮肥施用偏多，也会导致果实大、小粒的形成[11]。Holt等[12]的研究发现，‘赤霞珠’果实中酚类物质变化不仅取决于果实粒径的差异，还与自然因素（温度、降水、土壤湿度等）有关。Roby等[13]的研究发现，灌溉处理对葡萄果皮总花色苷和种子单宁含量的影响比粒径的影响大。果实粒径与葡萄酒品质并不是简单的线性关系[12]，很难剥离环境因素研究粒径本身对葡萄果实品质的影响。因此，本实验选取宁夏玉泉营地区的‘美乐’和‘蛇龙珠’葡萄，研究在相同环境和同一栽培管理技术下自然形成的不同果实粒径的葡萄品质间的差异，以期为酿造过程中的粒选工艺提供理论指导。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

本实验连续两年以宁夏永宁县玉泉营镇的‘美乐’和‘蛇龙珠’葡萄为试材，于2014、2015年分别开展实验。

氢氧化钠、硫酸铵、甲基纤维素、钨酸钠、钼酸钠、硫酸锂均为国产分析纯；甲醇、盐酸、乙腈、甲醇均为国产色谱纯；所有花色苷单体标样和单体酚标准品（均为色谱纯） 美国Sigma公司。

1.2 仪器与设备

高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）仪、UV-1700紫外-可见分光光度计 美国Agilent公司；5804R低温冷冻离心机德国Eppendorf公司；超声波振荡器 昆山禾创超声仪器有限公司；CentriVap 78100-40离心浓缩系统 美国LABCONCO公司；FA2004型电子天平 上海精科实业有限公司。

1.3 方法

1.3.1 采样及果实粒径分级

当葡萄达到商业成熟度时，分别随机采集5 kg样品，用冰袋运回实验室，贴近果蒂处用剪刀逐粒剪下，-40 ℃冰箱保存。用14、12 mm圆孔分样筛将‘美乐’果粒分为大于14 mm（大果粒，L）、12～14 mm（中等果粒，M）、小于12 mm（小果粒，S）3 个粒径等级；‘蛇龙珠’果粒用15、14 mm圆孔筛分为大于15 mm（大果粒，L1）、14～15 mm（中等果粒，M1）、小于14 mm（小果粒，S1）3 个等级；每次随机选取900 粒，进行3 次生物学重复，统计各粒径范围果粒所占比例。

1.3.2 果实基本指标的测定

各粒径范围的果粒随机选取100 粒称质量，剥皮、取籽，并称其果皮鲜质量、种子质量、单果粒种子数、单粒种子干质量，从而计算皮/果质量比（果皮鲜质量/果粒鲜质量×100）、种/果质量比（种子鲜质量/果粒鲜质量×100）。同时参照唐永红等[5]的方法，随机选取100 粒葡萄，揉碎过滤取汁，测定果汁的可溶性固形物质量分数（手持糖度计法）、可滴定酸质量浓度（NaOH滴定法）和pH值（pH计法）。同时，随机选取200 粒果实用于果皮中总酚[14]、单宁[15]、总花色苷[16]含量的测定。

1.3.3 果皮花色苷单体含量的测定

每个样品随机选取100 粒葡萄，在冷冻状态下剥皮，将果皮液氮速冻后打粉，置于冷冻干燥机干燥24 h后，称取0.5 g葡萄果皮干粉于离心管中，加入10 mL体积分数2%甲酸-甲醇溶液，避光超声10 min后25 ℃摇床振荡提取30 min，4 ℃、8 000 r/min离心5 min，取上清液，重复4 次。合并上清液于100 mL圆底烧瓶，用旋转蒸发仪31 ℃蒸干，残渣用流动相（V（流动相A）∶V（流动相B）＝9∶1）重新溶解并定容至10 mL，-40 ℃下保存备用，样品进样前用0.45 μm滤膜过滤[17]。HPLC条件参照王华等[18]的方法。

1.3.4 果皮单体酚含量的测定

取1.0 g待测葡萄果皮干粉（2015年）、5 mL蒸馏水和45 mL乙酸乙酯于三角瓶中，在25 ℃、150 r/min摇床中避光提取30 min，收集上清液于250 mL圆底烧瓶中，再重复加入45 mL乙酸乙酯提取3 次，合并4 次上清液并用旋转蒸发仪30 ℃蒸干，残渣用甲醇溶解并定容至2 mL，-40 ℃下保存待测，进样前用0.45 μm滤膜过滤[17]。HPLC条件参照成宇峰等[19]的方法。

1.4 数据统计与分析

采用Excel软件处理数据，利用SPSS 19.0软件对数据进行单因素方差分析和多重比较（Duncan新复极差法），P＜0.05表示差异显著，并用Excel软件作图。

2 结果与分析

2.1 果实粒径分布分析

图 1 葡萄果实粒径分布Fig. 1 Berry size distribution

如图1所示，‘美乐’连续两年的粒径分布均表现为中等果粒＞小果粒＞大果粒，且3 个粒径间差异显著，中等果粒所占比例都大于50%，大果粒都少于10%。‘蛇龙珠’连续两年的中等果粒所占比例均显著高于其他两种粒径，2014年小果粒所占比例显著高于大果粒，2015年则是大果粒所占比例显著高于小果粒。

2.2 果实粒径与基本品质指标分析

如表1所示，‘美乐’果实2014年的可溶性固形物质量分数随粒径的增大而降低，但2015年表现为中等果粒＞大果粒＞小果粒，且3 个粒径等级间差异显著；2014年可滴定酸质量浓度随粒径的减小而降低，而2015年则表现出相反的趋势，中、小果粒可滴定酸质量浓度显著高于大果粒。‘蛇龙珠’果实2014年的可溶性固形物质量分数变化情况与‘美乐’一致，也随着粒径的增大而降低，2015年也表现为中等果粒显著高于大、小果粒；2014年各粒径果粒间可滴定酸质量浓度无显著性差异，而2015年表现为大果粒＞小果粒＞中等果粒，且三者差异显著。2014年‘美乐’大果粒的pH值显著低于中、小果粒；2015年则表现为显著高于中、小果粒。‘蛇龙珠’果实连续两年的pH值都表现为中等果粒最低。

表 1 果实粒径与基本品质指标Table 1 Berry size and quality indicators

2.3 果实粒径与物理特性分析

表 2 果实粒径与物理特性Table 2 Berry size and physical characteristics

如表2所示，2014、2015年‘美乐’的皮/果质量比均随粒径的减小而增大；种/果质量比、单粒种子质量和单果粒种子数均表现为随粒径的减小而减小。‘蛇龙珠’的皮/果质量比在2014年表现为在小果粒（15.07%）中最高，2015年则为中等果粒（8.73%）最高；两年中种/果质量比和单果粒种子数都表现为随粒径的减小而减小；单粒种子质量表现为大果粒显著高于中等果粒和小果粒。

2.4 果实粒径与酚类物质含量分析

2.4.1 不同果实粒径对酚类物质含量的影响

由图2可看出，不同粒径间的酚类物质含量均差异显著。2014年，‘美乐’果实的总酚和总花色苷含量均表现为小果粒＞大果粒＞中等果粒；2015年，‘美乐’果实的总酚和花色苷含量则为中等果粒＞小果粒＞大果粒；两个年份‘美乐’果实的单宁含量均为小果粒显著高于大、中果粒。综合两个年份可知，‘美乐’小果粒和中等果粒中酚类物质含量较高。

图 2 不同粒径果粒的酚类物质含量Fig. 2 Phenolic contents of grapes of different sizes

2014年，‘蛇龙珠’果实的总酚和总花色苷含量均表现为大果粒＞小果粒＞中等果粒；2015年，‘蛇龙珠’果实的总酚和总花色苷含量均表现为中等果粒＞大果粒＞小果粒；两个年份果实单宁含量随粒径的减小而降低。综合两个年份结果可知，‘蛇龙珠’大果粒和中等果粒中酚类物质含量较高。

2.4.2 不同果实粒径对花色苷单体含量的影响

由表3可知，‘美乐’和‘蛇龙珠’葡萄果皮中都检测到9 种花色苷单体物质，包括5 种非酰化花色苷和4 种酰化花色苷，其含量受年份影响较大。2014年‘美乐’果实中的非酰化花色苷总量随粒径的增大而减少，除二甲花翠素葡萄糖苷表现为中等果粒含量较高外，其他非酰化花色苷含量都表现为小果粒＞中等果粒＞大果粒；酰化花色苷总量则为中等果粒（190.63 mg/kg）较高，大果粒（147.96 mg/kg）较低，除甲基花青素香豆酰化葡萄糖苷在小果粒中含量较高外，其他酰化花色苷单体均表现为中等果粒中含量较高；就花色苷总量而言，小果粒和中等果粒间差异不显著，但均显著高于大果粒。2015年‘美乐’果实中的非酰化花色苷总量变化趋势与2014年一致，也表现为小果粒中最高，大果粒中最低，除甲基花翠素葡萄糖苷和甲基花青素香豆酰化葡萄糖苷在中等果粒中含量较高外，其他非酰化单体花色苷均为小果粒中含量较高；酰化花色苷总量则表现为中等果粒（280.83 mg/kg）中最高，大果粒（102.57 mg/kg）中最低；花色苷单体总量表现为中等果粒（1 415.90 mg/kg）显著高于小果粒（1 285.91 mg/kg）和大果粒（500.61 mg/kg）。两年中同一个粒径范围的‘美乐’果粒花色苷单体含量变化很大，大果粒2015年所有花色苷单体含量均低于2014年；中等果粒2015年的非酰化花色苷总量相比2014年降低了15.9%，但酰化花色苷总量相比2014年增加了47.3%，花色苷单体总量相比2014年增加了1.3%；小果粒2015年花色苷单体总量相比于2014年降低了8%。综合两年数据可知，‘美乐’中等果粒葡萄皮中花色苷单体总量最高。

表 3 不同粒径果实花色苷单体含量Table 3 Contents of anthocyanin monomers in grapes of different sizes

2014年‘蛇龙珠’小果粒中所有花色苷单体含量均高于大果粒和中等果粒，小果粒花色苷总量（1 121.04 mg/kg）也显著高于大（794.68 mg/kg）、中（720.95 mg/kg）果粒，非酰化花色苷和酰化花色苷总量均表现为小果粒显著高于大果粒和中等果粒。2015年3 个粒径范围各花色苷单体含量均低于2014年，花色苷单体总量表现为大果粒显著高于中等果粒和小果粒，3 个粒径范围相比2014年分别降低了54.9%、50.4%和79.1%，非酰化花色苷和酰化花色苷总量均表现为大果粒显著高于中等果粒和小果粒。‘蛇龙珠’花色苷单体含量受年份影响较大。

2.4.3 不同果实粒径对单体酚含量的影响

表 4 2015年不同粒径果实单体酚含量Table 4 Contents of monomeric phenolic compounds in grapes of different sizes harvested in 2015

由表4可以看出，2015年‘美乐’大、中、小果粒中分别检测出26、24、24 种单体酚物质。中等果粒单体酚总量最高（29 763.27 μg/kg），略高于小果粒（29 569.68 μg/kg），显著高于大果粒（21 549.74 μg/kg）。原儿茶酸、表没食子儿茶素没食子酸酯和表儿茶素没食子酸酯在大果粒中含量较高，仅小果粒中检测出香草酸。小果粒中羟基苯甲酸类总量（52.14 μg/kg）显著高于大果粒（45.96 μg/kg）和中等果粒（23.57 μg/kg），大果粒中的所有黄烷醇类物质含量及总量均明显高于中、小果粒。大部分黄酮醇类物质在中等果粒和小果粒中含量较高，中等果粒总量最高，略高于小果粒，显著高于大果粒。

2015年‘蛇龙珠’大、中、小果粒中分别检测到22、24、24 种单体酚物质，单体酚总量在大果粒中最高（13 308.24 μg/kg），其次是小果粒（12 632.12 μg/kg），中等果粒中最低（11 190.02 μg/kg）。原儿茶酸和香草酸在中等果粒中含量最高，表没食子儿茶素没食子酸酯在小果粒中含量最高，中等果粒的羟基苯甲酸类物质总量（44.63 μg/kg）显著高于大果粒（30.00 μg/kg）和小果粒（40.37 μg/kg）。棓儿茶素和儿茶素在小果粒中含量较高，表棓儿茶素和表儿茶素含量在中等果粒中含量较高，其他黄烷醇类物质在大果粒中含量较高，大果粒中黄烷醇类物质总量（2 202.96 μg/kg）显著高于中等果粒（1 040.49 μg/kg）和小果粒（1 979.44 μg/kg）。槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸酐、槲皮素-3-O-半乳糖苷、杨梅酮和丁香亭在小果粒中含量较高，丁香亭-半乳糖苷和槲皮素-3-O-鼠李糖苷在中等果粒中含量较高，其他检出的黄酮醇类物质在大果粒中含量较高，大果粒中黄酮醇类物质总量（11 075.29 μg/kg）显著高于中等果粒（10 104.90 μg/kg）和小果粒（10 612.31 μg/kg）。

2.5 果实粒径与果实品质的主成分分析

图 3 不同粒径果粒的主成分得分散点图Fig. 3 Scatter plots of the fi rst two principal components for quality indicators of grapes of different berry sizes

用SPSS 19.0软件对不同果实粒径葡萄的可溶性固形物质量分数、可滴定酸质量浓度、pH值和总酚、总花色苷、单宁以及花色苷单体的含量进行主成分分析。由图3可知，2014年主成分1、2的累计贡献率为86.379%，第1主成分贡献率为52.441%，主要反映了二甲花翠素香豆酰化葡萄糖苷、总酚、单宁和花色苷单体含量等的变异情况；第2主成分贡献率为33.938%，主要反映了花翠素葡萄糖苷和3’-甲基花翠素葡萄糖苷含量等的变异信息。不同粒径‘美乐’和‘蛇龙珠’葡萄果实分布在不同的区域：不同粒径的‘美乐’葡萄都分布在第1主成分的负方向，小果粒和中等果粒的‘美乐’葡萄距离较近，主要受可溶性固形物质量分数和花青素葡萄糖苷、甲基花青素葡萄糖苷、甲基花青素乙酰化葡萄糖苷含量的影响；不同粒径的‘蛇龙珠’葡萄分布在第1主成分的正方向，小果粒的‘蛇龙珠’葡萄主要受pH值和甲基花青素香豆酰化葡萄糖苷等花色苷单体（Pn、Pt-co、Mv-ac）含量的影响。2015年主成分1、2的累计贡献率为85.240%，第1主成分贡献率为68.814%，主要反映了单宁、可溶性固形物质量分数、总酚含量和3’-甲基花翠素葡萄糖苷等花色苷单体（Mv、Dp、Mv-ac、Pt、Cy、Pn-ac）含量的变异信息；第2主成分贡献率为16.426%。不同粒径的‘美乐’葡萄分散于不同区域，且差异较大：小果粒和中等果粒‘美乐’分布在第1主成分的正方向，中等果粒主要受花色苷单体、总酚含量和可滴定酸质量浓度的影响；小果粒主要受一些花色苷单体（Pt、Dp、Cy、Pn-ac）含量的影响；大果粒的‘美乐’分布在第1主成分的负方向；不同粒径的‘蛇龙珠’葡萄分布在第2主成分的正方向，主要受单宁含量和pH值的影响。总地来说，不同葡萄品种和同一葡萄品种不同粒径间品质有差异，分布在不同区域，且差异在不同年份间不尽相同。

3 讨 论

酿酒葡萄果实粒径分布受外界土壤、地势和微环境等环境因素的影响。Rolle等[20]的研究表明，‘玫瑰香’葡萄的粒径分布为正态分布，即中等果粒所占比例最高；Gil等[21]的研究表明‘赤霞珠’葡萄中等果粒所占比例最高，本实验中‘美乐’和‘蛇龙珠’葡萄连续两年均为中等果粒比例较高，与前人研究结果一致。葡萄的皮/果质量比受外界环境影响较大，Roby等[22]的研究表明灌水量较低时，小果粒中皮/果质量比高；Barbagallo等[23]的研究表明皮/果质量比与粒径间没有显著的相关性，本实验中‘美乐’葡萄的皮/果质量比随粒径的减小而增大，但‘蛇龙珠’葡萄的皮/果质量比与粒径无此变化趋势，这可能与葡萄品种或粒径范围划分有关。‘美乐’和‘蛇龙珠’葡萄的种/果质量比随果实粒径的增大而增加，Barbagallo等[23]的研究也体现这一规律。单果粒种子数随果实粒径的增大而增加，和前人研究[24]一致。2014年‘美乐’和‘蛇龙珠’的可溶性固形物质量分数均随着果实粒径的增大而降低，相关研究也表明小果粒的葡萄中可溶性固形物质量分数较高[22,25]，2015年则表现为中等果粒质量分数较高。本实验中葡萄果实的可滴定酸质量浓度和pH值与果实粒径无明显的相关性，与前人研究结果[23]类似。

酿酒葡萄果实中酚类物质主要存在于果皮和种子中，酚类物质对葡萄酒的贡献取决于外界环境因素、栽培管理措施及发酵浸渍过程[26-27]。本实验中‘美乐’果实的单宁含量均为小果粒中最高；总酚和总花色苷含量2014年为小果粒＞大果粒＞中等果粒，2015年则为中等果粒＞小果粒＞大果粒。‘蛇龙珠’果实单宁含量随粒径的增大而增加，且在大果粒中最高；2014年总酚和总花色苷含量为大果粒＞小果粒＞中等果粒，2015年则为中等果粒＞大果粒＞小果粒。Romerocascales等[28]的研究发现‘慕合怀特’（‘Mourvèdre’）葡萄的花色苷和单宁浓度为小果粒比大果粒更高。Barbagallo等[23]的研究表明小果粒的‘玫瑰香’葡萄花色苷总量较高。Matthews等[26]发现葡萄果皮中约70%酚类物质含量的变化都可以由果皮相对质量的变化来解释，因为小果粒中皮/果质量比较高，所以其花色苷总量较高。Roby等[22]也发现果皮中单宁和花色苷浓度与果皮的相对质量即皮/果质量比间呈线性正相关。本实验中的‘蛇龙珠’葡萄的皮/果质量比与粒径不相关，但‘美乐’葡萄的皮/果质量比随粒径的减小而增大，可以解释葡萄酚类物质含量与粒径的关系，但其受年份影响也较大。Roby等[22]的研究还表明，果皮中单宁浓度随果粒的增大有略微减小的趋势，但在中等果粒范围内相对稳定，果皮中花色苷浓度随果实粒径的增大而减小，但中等粒径范围果实花色苷浓度有波动，且不是呈严格的线性关系。由于粒径划分范围的不同，可能会出现本研究中‘蛇龙珠’葡萄大、中果粒酚类物质质量分数较高的现象。

本实验中‘美乐’和‘蛇龙珠’葡萄都检测到9 种花色苷单体物质，包括5 种非酰化花色苷和4 种酰化花色苷，不同粒径范围含量差异比较明显，同一个粒径范围的果粒连续两年的花色苷单体含量差异也很大。实验中发现果实粒径对其花色苷单体组分并没有显著影响，与前人的结论[20]一致。就花色苷单体总量而言，‘美乐’葡萄连续两年都表现为中等果粒中较高；‘蛇龙珠’葡萄2014年非酰化花色苷和酰化花色苷总量均表现为小果粒显著高于大果粒和中等果粒，2015年则为大果粒显著高于中等果粒和小果粒。本实验中‘美乐’和‘蛇龙珠’葡萄的花色苷单体含量受年份影响较大。

单体酚是指除花色苷以外的酚类，主要包括酚酸类（苯甲酸类、肉桂酸类）、黄酮醇类（黄烷酮类、黄酮醇类、黄酮类）、黄烷-3-醇类，以及一些特殊的酚类物质等。本实验中主要检测了葡萄果实中羟基苯甲酸类、黄烷醇类以及黄酮醇类物质含量。Rolle等[20]的研究表明‘玫瑰香’总类黄酮和原花青素含量在小果粒中较高，Baiano等[29]也发现小果粒中单体酚总量较高。黄酮醇类物质占单体酚总量的80%以上，其含量的高低基本可以决定单体酚总量的高低。黄酮醇具有保护葡萄免受紫外线伤害、清除自由基的功能。本研究中，中等果粒‘美乐’葡萄的黄酮醇类物质总量略高于小果粒，显著高于大果粒；‘蛇龙珠’葡萄黄酮醇类物质总量在大果粒中较高，与前人的结果不完全一致，可能由于对果实粒径的定义不同所致。

从本研究中可看出，不同粒径的葡萄果实品质有差异，且受年份影响较大。‘美乐’葡萄的花色苷和单体酚等酚类物质含量表现为中等果粒较高，‘蛇龙珠’葡萄则为大果粒中较高。本研究结果为酿造优质葡萄酒的粒选工艺提供理论依据。