深海鲣鱼鱼油对D-半乳糖致衰老模型小鼠抗衰老的作用

郑霖波，白 冬，虞 舟，张海玲，谢 超,*

（1.浙江海洋大学食品与医药学院，浙江 舟山 316022；2.舟山昌国食品有限公司，浙江 舟山 316021；3.舟山富晟食品科技有限公司，浙江 舟山 316025）

鲣鱼（Katsuwonus pelamis），俗称炸弹鱼，属于金枪鱼科（Thunnidae），其产量占金枪鱼渔业的40%之多[1-3]。鲣鱼蛋白质含量高，氨基酸比例合理，且种类丰富；胆固醇和脂肪含量低，而且二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）和二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA）等多不饱和脂肪酸、ω-3多不饱和脂肪酸和矿物质元素含量丰富，氨基酸配比合理，符合现代人群健康饮食消费观念，是很好的蛋白质来源食品及便于人体吸收利用的健康食品[4-6]。高颐雄[7]研究了舟山海域的31 种海鱼中脂肪酸含量，发现扁舵鲣的总脂肪高达13.2%，且ω-3多不饱和脂肪酸质量分数最高，为2.62%。也有研究报道，金枪鱼和鲣鱼等大型洄游性鱼的内脏和眼窝中含有30%～40% DHA以及5%～10% EPA[8-9]。周敏等[10]测定了黄鳍金枪鱼眼窝油中DHA含量为19.6 mg/g，占总脂肪质量的27.1%，比例较高，适用于DHA相关产品的开发。

衰老又称老化，是各生物必然经历的一种过程，是生物在正常状况下发育成熟之后，机体各组织器官功能随时间的流逝而减退，自身应急免疫能力下降，内环境产生不稳定因素，各结构组分发生不可抗拒的退行变化现象[11-13]。衰老不可逆转，但是可以进行干预以延缓衰老[14-15]，保持机体具有足够的抗氧化物质，增加抗氧化酶活力，及时清除机体内过量的自由基，减缓其对细胞和组织的破坏，从而维持细胞和组织的正常功能，达到保持机体健康和抗衰老的目的[16-17]。深海鱼油中富含DHA和EPA等多不饱和脂肪酸，对人体正常发育和保持健康有重要意义，还可预防和治疗多种疾病[18-19]，幼儿及青少年及时补充DHA和EPA，可促进其视力以及智力的发育，中老年人及时补充可预防延缓由衰老所带来的一系列疾病，如心脑血管疾病、高血压、高血脂、视力下降、阿尔茨海默病等症状[20-22]。

目前鲣鱼肌肉营养成分的分析和评价与保鲜维持品质的研究报道较多，鲜有有关鲣鱼鱼油生物活性功能的评价，本实验探讨深海鲣鱼鱼油对D-半乳糖诱导的亚急性衰老小鼠抗衰老功能的影响，以期为鲣鱼油抗氧化、抗衰老能力提供新的理论数据，也为鲣鱼的综合开发利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 动物、材料与试剂

雄性ICR小鼠，平均体质量18～22 g，购于浙江省实验动物质量监督检测站，许可证号：SCXK（沪）2017-0005。

鲣鱼鱼油由实验室提取、精制（DHA、EPA质量分数45%，高于一般市售鱼油）；金枪鱼油（主要原料为金枪鱼油、VE、柠檬酸，其中DHA、EPA质量分数29.6%） 上海恒寿堂药业有限公司。

D-半乳糖、冰醋酸 国药集团化学试剂有限公司；谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）试剂盒、总超氧化物歧化酶（total superoxide dismutase，T-SOD）试剂盒、丙二醛（malondialdehyde，MDA）测定试剂盒、过氧化氢酶（catalase，CAT）试剂盒 南京建成生物工程研究所。

1.2 仪器与设备

BT125D型电子天平 赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；16K-M高速离心机 长沙鑫奥仪器仪表有限公司；酶标仪 美国Thermo Fisher公司。

1.3 方法

1.3.1 小鼠分组

将小鼠（（20±2）g）在清洁安静、温度适宜的动物房适应性饲养，饲养条件：（25±2）℃下每12 h昼夜交替照明。3 d后取出，随机分成6 组，每组8 只，即空白对照组（BC）；鲣鱼鱼油组：低剂量组（LD）、中剂量组（MD）、高剂量组（HD）；D-半乳糖模型组（NC）；阳性对照组（PC）。

1.3.2 小鼠给药

采用皮下注射方式，给鲣鱼鱼油组、阳性对照组和D-半乳糖模型组每只小鼠每天注射质量分数为4%的D-半乳糖（1 000 mg/kg mb），空白组小鼠每只每天注射等体积0.9%的生理盐水，连续注射6 周。注射4% D-半乳糖的同时，鲣鱼鱼油组分别每天灌胃10 mL/kg mb不同质量浓度的鱼油（低、中、高剂量组分别为20、50、100 mg/mL），阳性对照组灌胃市售鱼油（100 mg/kg mb），空白对照组和D-半乳糖模型组灌胃等体积生理盐水[23]。

1.3.3 小鼠灌胃

用左手抓紧小鼠背部和头部的皮毛，使其固定，并使其头部后仰，与身体成一水平直线，将针头自口腔右侧沿上颚垂直缓慢下行，灌药，观察小鼠呼吸是否正常[24]。

1.3.4 组织处理及准备

血清准备：采血前12 h 禁食，采血1 h前禁水，选用眼球摘除采血法采血，立即4 000 r/min离心15 min取血清，-80 ℃保存[25]。

肝组织处理：脱颈处死小鼠后，剪开腹腔完整取出小鼠肝脏后用4 ℃生理盐水清洗，滤纸吸干，保存在Bouin氏固定液中，制作石蜡切片并进行苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色观察肝脏组织病理变化情况。

肝匀浆制备：脱颈处死小鼠后，剪开腹腔完整取出小鼠肝脏加入4 ℃预冷生理盐水制成10%的肝脏组织匀浆，低温离心机4 ℃、3 000 r/min离心10～15 min，取上清液，加入生理盐水配制成实验所需的各浓度，4 ℃保存待测。

1.3.5 肝脾指数的计算

根据公式（1）、（2）分别计算肝指数和脾指数。

1.3.6 生化指标的测定

测定GSH-Px、T-SOD、CAT活力以及MDA含量等指标，具体操作参照试剂盒说明书。

1.3.7 肝脏切片及HE染色

小鼠肝脏组织于Bouin氏固定液中固定24 h，取出修整，梯度乙醇脱水后常规石蜡包埋，连续切3 μm厚切片、染色、脱水后封片，然后在光学电子显微镜下观察肝组织病理变化情况[26-27]。

1.4 数据处理与分析

数据处理及作图采用Origin 8.1、SPSS 13.0软件，结果表示为平均值±标准差，采用SNK法分析差异显著性。

2 结果与分析

2.1 小鼠肝指数和脾指数

图 1 各组小鼠的肝指数Fig. 1 Liver index of mice in different groups

图 2 各组小鼠的脾指数Fig. 2 Thymus index of mice in different groups

由图1所示，与模型组相比，鲣鱼鱼油中、高剂量组和空白对照组的肝指数呈显著下降趋势（P＜0.05），低剂量组肝指数表现出一定的下降趋势（P＞0.05）。由图2可知，鲣鱼鱼油高剂量组、空白对照组和阳性对照组与模型组相比脾指数显著下降（P＜0.05），低、中剂量组表现出下降趋势，但差异并不显著。结果表明鲣鱼鱼油可在一定程度上降低小鼠肝、脾指数。

2.2 小鼠肝脏生化指标

表 1 鲣鱼鱼油对衰老小鼠肝匀浆中GSH-Px、T-SOD、CAT活力和MDA含量的影响（n＝8）Table 1 Effect of skipjack tuna oil on GSH-Px, T-SOD and CAT activity and MDA content in liver homogenate of aging mice (n= 8)

大量实验证明，小鼠经D-半乳糖注射诱导可以导致其加速衰老，并且有类似于自然衰老的各种生理生化的老化表现[28-29]。由表1可知，与空白对照组相比，D-半乳糖模型组中GSH-Px、T-SOD、CAT活力均极显著降低（P＜0.01），MDA含量极显著升高（P＜0.01），说明D-半乳糖致衰老型小鼠造模成功。与D-半乳糖模型组相比，鲣鱼鱼油各剂量组与阳性对照组均显著提升了肝匀浆GSH-Px、T-SOD、CAT活力（P＜0.05），且各指标随鲣鱼鱼油剂量的增加而升高，均降低了MDA含量。说明鲣鱼鱼油能够提高肝组织GSH-Px、T-SOD、CAT活力，降低MDA含量，有缓解衰老的效果，且高剂量组的作用最为明显。这表示鲣鱼鱼油中不饱和脂肪酸有可能替代了机体内的还原物质，使其免受氧化而维持了正常的生理功能。

2.3 小鼠血液生化指标

表 2 鲣鱼鱼油对衰老小鼠血清中GSH-Px、T-SOD、CAT活力和MDA浓度的影响（n＝8）Table 2 Effect of skipjack tuna oil on GSH-Px, T-SOD and CAT activity and MDA concentration in serum of aging mice (n= 8)

由表2可知，D-半乳糖模型组与空白对照组相比，血清中GSH-Px、T-SOD活力极显著下降（P＜0.01），CAT活力显著下降（P＜0.05），MDA浓度极显著上升（P＜0.01），再次验证造模成功。与D-半乳糖模型组相比，高剂量组可极显著提升GSH-Px、T-SOD、CAT活力（P＜0.01）并降低MDA浓度（P＜0.01）；中剂量组能极显著提高GSH-Px活力（P＜0.01），极显著降低MDA浓度（P＜0.01）；阳性对照组能够极显著提升GSH-Px活力（P＜0.01），T-SOD和CAT活力升高显著（P＜0.05），MDA浓度极显著下降（P＜0.01）。说明鲣鱼鱼油中、高剂量组缓解衰老的效果与市售鱼油的效果相似，均可提升GSH-Px、T-SOD、CAT活力，且使细胞中MDA浓度下降到正常水平从而达到延缓衰老的作用。

2.4 小鼠肝脏组织切片观察分析

图 3 小鼠各组肝组织切片HE染色结果（100×）Fig. 3 Hematoxylin and eosin staining of liver tissue of mice in all groups (100 ×)

如图3所示，空白对照组小鼠中央静脉结构正常，呈较为规则的圆形，肝窦正常，肝索排列规范无异常，肝小叶和肝细胞结构正常；D-半乳糖模型组与空白对照组相比，肝索排列杂乱无序，肝窦扩张明显，肝小叶结构异常，肝细胞体积缩小，部分细胞可见双核；阳性对照组肝细胞体积较D-半乳糖模型组增大，肝小叶结构正常，肝索排列整齐规范，肝窦无明显扩张；高剂量组肝细胞大小与结构未见明显异常，肝小叶结构无异常，肝窦无扩张，肝索排列结构正常；中剂量组肝细胞结构正常，排列规范，肝窦未见明显扩张，肝小叶与肝索结构无异常；低剂量组部分肝细胞体积增大，出现双核细胞，肝索及肝窦结构未见明显异常[30-32]。

由此可见，鲣鱼鱼油可减缓细胞和组织结构的破坏，保护细胞以及组织功能正常，延缓衰老的进程。

3 结 论

实验结果显示，皮下注射D-半乳糖小鼠连续摄入鲣鱼鱼油6 周后，小鼠体内抗氧化酶（GSH-Px、T-SOD及CAT）活力显著升高，MDA浓度明显下降，与D-半乳糖模型组相比差异有显著性，且效果与鲣鱼鱼油摄入含量成正比。鲣鱼鱼油含有丰富的不饱和脂肪酸，特别是DHA和EPA，因此含有丰富的不饱和键，其可代替生物机体完成正常代谢过程中的氧化环节，有效地清除过量自由基，减少脂质过氧化物的产生，增强抗氧化酶活力进一步提升清除自由基的能力。同时，观察肝脏切片HE染色结果可知，相比于D-半乳糖模型组，鲣鱼鱼油制剂组肝细胞大小与结构未见明显异常，肝小叶结构无异常，肝窦无扩张，肝索排列结构正常，高剂量组与空白对照组染色结果相似，效果较佳。