前列腺癌组织中具有潜在生物标记物特性的miRNA及其靶基因生物学功能、信号通路分析

王金龙，刘芳晓，赵燕云，魏敏杰，何苗

(1中国医科大学药学院药理教研室，沈阳110122；2辽宁省分子靶向抗肿瘤药物药理学研究与评价重点实验室)

前列腺癌是男性泌尿生殖系统较常见的恶性肿瘤之一。目前，前列腺癌发病率位居男性恶性肿瘤的第2位[1]。2015年，我国前列腺癌发病率位居男性肿瘤发病率第6位，且前列腺癌的发病率、病死率逐年升高[2]。99%以上的前列腺癌患者为年龄≥50岁的男性[3]。目前，前列腺癌已成为严重威胁我国老龄男性健康的恶性疾病。以前临床主要通过TNM 分期、Gleason 评分[4]、血清前列腺特异性抗原(PSA)[5]的表达及年龄种族等指标评价前列腺癌患者的预后，但以上指标存在特异度不高、需要过度穿刺活检等问题。寻找特异度、灵敏度更高的前列腺癌诊断标记物已成为目前研究热点。分子标志物的发现和应用为前列腺癌预后评估提供了更可靠、更准确的判断依据[6]。微小RNA(miRNAs)在肿瘤的诊断、治疗中应用越来越多[7]。研究[8]证明，miRNAs可通过结合3′-非翻译区(3′-UTR)负向调节靶mRNA的翻译，在发育、分化、代谢[9]及细胞增殖、凋亡、衰老等细胞特征和干细胞维持[10]等各种生理和病理过程中发挥重要作用。但哪些miRNAs在前列腺癌组织中存在异常表达，是否可成为前列腺癌生物标记物，目前尚不清楚。2018年6～8月，本研究利用癌症和肿瘤基因图谱计划(TCGA)数据库中mRNA数据，分析前列腺癌组织、癌旁组织 miRNA的表达情况， 筛选前列腺癌组织中具有潜在生物标记物特征的 miRNA，并分析其靶基因的生物学功能及信号通路，旨在为临床进一步验证其是否可成为准确可靠的前列腺癌预后标志物奠定基础。

1 材料与方法

1.1 前列腺癌组织、癌旁组织miRNAs表达比较 下载TCGA(https://cancergenome.nih.gov)中前列腺癌高通量测序表达谱数据及miRNA表达谱数据(时间截止为2018年6月22日)，并通过R软件(https://www.r-project.org)对上述前列腺癌相关miRNA表达数据进行预处理，筛选出差异表达基因(DEGs)，阈值设为False Discovery Rate错误发现率(FDR)<0.05，差异表达倍数|FC|>1。火山图横轴为-Log10(FDR)，值越大表达差异越显著；纵轴为LogFC，越偏离中心差异表达倍数越大。横轴上方点代表高表达的miRNA(LogFC>1),横轴下方绿色的点代表低表达的miRNA(LogFC<-1)。最终纳入52例癌旁组织标本和499例前列腺癌组织标本。

1.2 前列腺癌组织中高表达且预后差 miRNA筛选 使用R语言程序包(edgeR 包)绘制出前列腺癌组织miRNA表达的热图和火山图，采用Kaplan-Meier生存曲线分析前列腺癌患者的生存情况，筛选出具有潜在生物标记物特性(高表达、预后差)的miRNA。

1.3 前列腺癌中高表达、预后差miRNA的靶基因生物学功能及信号通路分析

1.3.1 miRNA靶基因的维恩图分析 利用在线软件(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)将Targetscan网站(http://www.targetscan.org/vert_72/)和 miRDB(http://www.mirdb.org)网站，以及DIANA TOOL(http://diana.imis.athena-innovation.gr/DianaTools/index.phpr=site/index)网站中得出的靶基因取交集，以此来提高准确率并缩小范围。

1.3.2 miRNA 靶基因富集分析 我们将差异表达基因数据导入在线网站DAVID(https://david.ncifcrf.gov/home.jsp)6.7，以FDR(<0.05作为入选标准，进行基因本体(GO)富集分析和京都基因和基因组百科全书(KEGG)通路富集分析。对表达差异明显的基因进行功能注释，分析这些基因主要参与的生物学过程以及主要涉及的肿瘤相关通路。

1.4 统计学方法 采用edgeR统计学方法筛选出DEGs，阈值设为FDR<0.05，|FC|>1。利用Kaplan-Meier法进行生存分析，筛选与前列腺癌预后相关的miRNA。计量资料以χ2表示，两组数据比较采用配对t检验。P< 0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

在前列腺癌组织、癌旁组织中共159个差异表达miRNA，其中表达下调59个、表达上调100个。

Kaplan-Meier生存曲线结果显示，miR-17高表达的前列腺癌患者预后不良，前列腺癌患者miR-17表达的生存曲线(见图1)。

图1 前列腺癌组织miR-17表达的生存曲线

在52例配对前列腺癌及癌旁组织标本miR-17相对表达量分别为3 852.66±1 800.41、1 581.22±391.71，二者比较，P<0.001)。Targetscan网站、miRDB网站、DIANA TOOL网站预测结果取交集可以得到miR-17共138个靶基因。

主要参与转录DNA模版化、蛋白质磷酸化、甲基胞嘧啶分解代谢、正调控凋亡过程、钠离子跨膜转运、胞质分裂等生物学过程(见图2A)；主要的分子功能包括它们与蛋白激酶结合、核酸结合、金属离子结合、钙离子结合、蛋白质结合等(见图2B)。与miR-17有关的信号通路有雌激素信号通路、cAMP信号传导途径、趋化因子信号通路、HIF-1信号通路和癌症蛋白聚糖信号通路等13条信号通路(见图2C)。

注：图A为miR-17靶基因参与的生物过程；图B为miR-17靶基因的分子功能;图C为miR-17靶基因参与的信号通路

图2miR-17靶基因生物学功能及信号通路分析结果

3 讨论

本研究通过TCGA数据库中52例癌旁组织和499例前列腺癌组织样本共筛选出159个差异表达miRNA，其中上调表达miRNA100个，下调表达miRNA59个。在100个上调的差异表达miRNA中进一步筛选出2个与预后相关，然后由P值和预后生存曲线共同确定选出其中最可成为潜在生物标记物的miRNA-miR-17，并重点对miR-17进行更深层次的研究，对miR-17在癌旁组织与前列腺癌组织中的差异表达进行分析，然后利用三种常见的数据库预测其靶基因，并对预测出的靶基因功能进行GO富集与KEGG分析，富集结果显示miR-17的下游靶基因与调节细胞自噬，蛋白质磷酸化，转录因子活性和细胞凋亡等密切相关。通过对miR-17的进一步研究，相信这将会为前列腺癌病人的早期诊断，有效治疗及预后开辟一条新的道路。

miRNA是长度为19～24个碱基的高度保守的单链非编码RNA。在许多发育和生理过程中都很重要，其作用主要是通过它的种子序列与靶基因的3′-非翻译区(3′-UTR)结合进而调节靶基因的表达，在细胞分化，增殖，胚胎发育以及免疫反馈机制等生命活动中起到重要作用[11～13]。而且，在肿瘤发生发展中microRNA以促癌或抑癌基因角色参与其中[14, 15]，其表达异常影响细胞增殖，凋亡，侵袭和转移等肿瘤不良形态，进而参与肿瘤的发生发展及其转录调控网络。miR-17在肿瘤发生发展中发挥不同的作用。miR-17可通过影响BRCA1的表达在家族性和弥散性乳腺癌中发挥作用[15]，在实体肿瘤细胞中通过靶向Mekk2恢复miR-17/20a的表达，增强自然杀伤细胞的抗肿瘤活性[16]。但是目前对于miR-17在前列腺癌中的表达及其作用还没有明确深入的研究。近年来随着生物信息学的快速发展，对于肿瘤的探索有了全面的应用，比如基因芯片和后续的二代高通量测序等等都使得研究人员可以清楚的了解到基因层面的表达数据及变化。miRNAs在包括前列腺癌在内的众多肿瘤中的表达与正常组织相比有明显差异。以此我们可以筛选出前列腺癌[17]特异性以及靶向治疗方面有关的新型肿瘤标记物[18]从而做到早期诊断和靶向治疗的目的。

本研究通过生物信息学方法探讨miR-17在前列腺癌中的表达及其靶基因的功能进而影响前列腺癌发生发展的过程，这是一种新兴的手段来研究前列腺癌可能的发病机制及其潜在的预后标记物，不仅丰富了我们对前列腺癌已知发病机制的认知，同时为今后对其发生发展的研究提供了可用的基础。我们利用TCGA数据库中前列腺癌的数据以此来收集与前列腺癌相关的基因表达数据。将癌组织与非癌组织样本数据进行比对分析，筛选出与前列腺癌发生发展有关联的miRNA标记物。因为miR-17在前列腺癌组织中异常高表达，而且在Kaplan-Meier预后生存曲线分析结果可见其高表达提示预后差。这些结果表明检测前列腺癌组织中miR-17的表达具有非常重要的临床意义。但是目前的大多数研究还局限于实验室层面，microRNA直接用于临床的研究还需要进一步确认，发展。因此，我们要更加深入地对microRNA在前列腺癌的作用加以研究，以此为前列腺的临床早期诊断以及治疗提供帮助。

综上所述，前列腺癌组织、癌旁组织共159个差异表达miRNA，其中表达下调59个、表达上调100个。miR-17高表达的前列腺癌患者预后差。miR-17共138个靶基因，主要参与转录DNA模版化、蛋白质磷酸化、甲基胞嘧啶分解代谢、正调控凋亡过程、钠离子跨膜转运、胞质分裂等生物学过程；主要分子功能包括它们与蛋白激酶结合、核酸结合、金属离子结合、钙离子结合、蛋白质结合等。与miR-17有关的信号通路有雌激素信号通路、cAMP信号传导途径、趋化因子信号通路、HIF-1信号通路和癌症蛋白聚糖信号通路等13条信号通路。miR-17可作为前列腺癌发生和预后评价的潜在生物标记物。但miR-17与前列腺癌的相关性还需要大样本的研究来证实与支持。