肉豆蔻-8散对心肌缺血再灌注损伤大鼠心肌组织中3种磷酸腺苷的影响

张媛彦， 肖云峰， 李文妍， 郭 娜， 王玉华∗

（1.内蒙古医科大学药学院，内蒙古 呼和浩特 010110；2.内蒙古医科大学新药安全评价研究中心，内蒙古呼和浩特010110；3.内蒙古自治区人民医院，内蒙古呼和浩特010110）

肉豆蔻-8散由沉香、肉豆蔻、丁香、广枣、木香、旋覆花、阿魏、牦牛心8味药材组成，最早收录于 《普济方集》中，具有镇 “赫依”、止痛、温胃、祛 “巴达干”、燥“协日乌素”功效，临床主要用于治疗心 “赫依”热、心烦、气短、失眠、心供血不足、心区疼痛、风湿性心脏病［1］。

现代研究表明，三磷酸腺苷、二磷酸腺苷、一磷酸腺苷含有量与改善心肌缺氧和能量代谢有关，其中三磷酸腺苷是心肌组织维持正常生命活动所必需的能量物质，而二磷酸腺苷、一磷酸腺苷是三磷酸腺苷降解产物，心肌组织内三者含有量变化可直接反映心肌能量代谢水平［2-3］。本实验采用HPLC法测定大鼠心肌组织中三磷酸腺苷、二磷酸腺苷、一磷酸腺苷的含有量［4-6］，以探讨肉豆蔻-8散与改善能量代谢的关系，以及该方抗心肌缺血再灌注损伤的作用机制。

1 材料

1.1 试药 肉豆蔻-8散 （内蒙古医科大学药学院，批号201705）。复方丹参滴丸 （天士力制药集团股份有限公司，批号 140822）。 5′-三磷酸腺苷钠盐 （批号 SLBQ6014V）、5′-一磷酸腺苷钠盐 （批号BCBT3249） （美国Sigma公司）；5′-二磷酸腺苷 （上海源叶生物科技有限公司，批号M04A6Y2139）；水合氯醛 （国药集团化学试剂有限公司，批号20151217）。甲醇为色谱纯；KH2PO4、NaOH、KOH、HClO4均为国产分析纯。

1.2 动物 雄性Wistar大鼠60只，体质量250～280 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，实验动物生产许可证号SCXK （京）2014-0001。

1.3 仪器 生物机能实验系统 （成都泰盟科技有限公司，型号BL-420S）；小动物呼吸机 （上海玉研科学仪器有限公司，型号V-100）；高速冷冻离心机 （长沙湘智离心机仪器有限公司，型号3H16R1）；高效液相色谱仪 ［赛默飞世尔科技 （中国）有限公司，型号Ultimate 3000］；电子天平（奥豪斯仪器有限公司，型号 DV215CD）；旋涡混合器（美国Scientific Industries公司，型号Vortex-Genie 2）；高端超纯水系统 （美国艾科浦国际有限公司，型号ALH-6000-U）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Thermo Hypersil C18色谱柱 （250 mm×4.6 mm， 5 μm）； 流动相甲醇-50 mmol／L 磷酸钾缓冲液（pH 6.68） （7∶93）；柱温25℃；UV检测器，检测波长259 nm；体积流量1.0 mL／min；进样量10 μL。色谱图见图1。

图1 各成分HPLC色谱图

2.2 对照品溶液制备 精密称取三磷酸腺苷、二磷酸腺苷、一磷酸腺苷对照品适量，置于10 mL量瓶中，超纯水稀释至刻度，摇匀，制成质量浓度分别为1.012、1.060、4.160 mg／mL的溶液，即得，4℃下避光保存。

2.3 样品制备 于液氮中取出冻存的心肌组织，称取约100 mg置于研钵中， 加入300 μL 0.4 mol／L预冷 HClO4溶液匀浆，0℃下 3 500 r／min离心 10 min，取上清液，1 mol／L KOH调 pH至6.5左右，0℃下3 500 r／min离心10 min，取上清液，0.45 μm微孔滤膜过滤，即得。

2.4 统计学分析 通过SPSS 22.0软件进行处理，数据用（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD检验。以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2.5 方法学考察

2.5.1 线性关系考察 精密吸取三磷酸腺苷、一磷酸腺苷对照品溶液 5、 10、 20、 40、 80、 160、 320 μL， 二磷酸腺苷对照品溶液 10、 20、 40、 80、 160、 320、 640 μL于量瓶中，超纯水定容至2 mL，制成7个质量浓度，在 “2.1”项色谱条件下进样测定。以峰面积为纵坐标 （Y），对照品溶液质量浓度为横坐标 （X）进行回归，结果见表1，可知各成分在各自范围内线性关系良好。

表1 各成分线性关系

2.5.2 精密度试验 取 “2.5.1”项下溶液，在 “2.1”项色谱条件下进样测定5次，连续5 d，测得三磷酸腺苷、二磷酸腺苷、一磷酸腺苷日内精密度RSD分别为0.13%、0.07%、0.12%，日间精密度RSD分别为8.68%、2.32%、0.81%，表明该方法符合生物样品分析要求。

2.5.3 稳定性试验 称取心肌组织约100 mg，按 “2.3”项下方法制备样品， 于0、4、8、12、24 h在 “2.1” 项色谱条件下进样测定，测得三磷酸腺苷、二磷酸腺苷、一磷酸腺苷在室温下峰面积 RSD分别为9.48%、3.08%、0.83%，冷藏下峰面积RSD分别8.81%、2.31%、0.54%，表明样品在24 h内稳定性良好。

2.5.4 加样回收率试验［4］向三磷酸腺苷、二磷酸腺苷、一磷酸腺苷含有量已知的大鼠心肌匀浆样品中加入相应对照品，配制成低、中、高3个质量浓度，平行3份，在“2.1”项色谱条件下进样测定，计算回收率，结果见表2。

表2 各成分加样回收率试验结果 （n＝9）

2.6 分组及给药 60只大鼠随机分为假手术组、模型组、阳性药组及肉豆蔻-8散高、中、低剂量组，每组10只。假手术组、模型组均给予0.5%羧甲基纤维素钠溶液，肉豆蔻-8散高、中、低剂量组分别给予21.6、10.8、5.4 mg／kg相应羧甲基纤维素钠混悬液，阳性药组给予0.729 mg／kg复方丹参滴丸羧甲基纤维素钠混悬液，剂量均为10 mL／kg，每天灌胃1次，连续15 d，于末次给药1 h后开始造模。

2.7 造模 大鼠腹腔注射10%水合氯醛 （3 mL／kg）麻醉后仰卧固定，四肢皮下连接心电图电极，记录正常标准Ⅱ导联心电图，待稳定后经口腔沿环状软骨走向进行气管插管，连接小动物呼吸机，呼吸频率 70次／min，潮气量15 mL，呼吸比1∶2，呼吸稳定后碘伏消毒，左前胸备皮，沿胸骨左缘2 mm处纵向切开第3～4肋间皮肤，钝性分离皮下组织、胸大肌、前锯肌，暴露肋骨与肋间肌，钝性分离后者，乳突撑开器于3～4肋骨间撑开肋骨，撕破心包，暴露心脏，用7-0带线缝合针于左心耳与肺动脉圆锥间即左心耳下缘1～2 mm处进针，经左冠状动脉左前降支下浅层心肌穿线结扎，进针深度约1 mm，宽度约1～2 mm，冠状前降支面置硅胶管连同冠脉缝合线一起结扎，45 s后剪去结扎线，连同硅胶管一同取出，恢复再灌注。然后，逐层缝合关胸，再次记录心电图，以心电图ST段、T波抬高作为衡量模型制备成功与否的标准［7-8］，假手术组只在心脏相应部位穿线不结扎。

2.8 心肌匀浆样品含有量测定 术后24 h，大鼠腹腔注射10%水合氯醛 （3 mL／kg）麻醉，迅速剪取心脏，于液氮中冻存。检测前取出心脏组织，切取约100 mg，按 “2.3”项下方法处理心肌组织，在 “2.1”项色谱条件下进样测定，计算含有量［9］，结果见表3。

表3 各成分含有量测定结果 （±s， n＝10， μmol／g）

表3 各成分含有量测定结果 （±s， n＝10， μmol／g）

注：与假手术组比较，∗P＜0.05，∗∗P＜0.01；与模型组比较，＃＃P＜0.01；与阳性药组比较，△△P＜0.01

组别 三磷酸腺苷 二磷酸腺苷 一磷酸腺苷假手术组 0.161±0.009 20 0.675±0.318 2.209±0.230模型组 0.029 8±0.003 80∗∗ 0.345±0.051 8∗∗ 3.942±0.382∗∗肉豆蔻-8散低剂量组 0.039 7±0.009 60∗∗＃＃△△ 0.377±0.041 9∗∗△△ 3.060±0.461∗∗＃＃△△肉豆蔻-8散中剂量组 0.077 0±0.006 97∗∗＃＃△△ 0.507±0.050 4∗∗＃＃△△ 3.011±0.163∗∗＃＃△△肉豆蔻-8散高剂量组 0.129±0.009 63∗∗＃＃△△ 0.658±0.085 3＃＃ 2.667±0.331∗∗＃＃阳性药组 0.146±0.010 6∗∗＃＃ 0.667±0.092 7＃＃ 2.540±0.218∗＃＃

3 讨论

3.1 流动相及其pH考察 色谱条件筛选结果显示，不同pH对色谱峰峰形和分离度有很大影响，当pH在6.00～6.50之间时，三磷酸腺苷、二磷酸腺苷、一磷酸腺苷无法完全分离，而pH 6.68时三者峰形和分离效果最佳，但磷酸盐缓冲液 （pH＝6.68）作为流动相时，对色谱柱的损伤较大，而加入甲醇后对其损伤程度减小。再比较2%～10%甲醇对色谱图的影响，发现随甲醇体积分数增加，出峰时间提前，而且7%甲醇出峰时间适宜，分离效果最优。最终确定，流动相为甲醇-50 mmol／L磷酸钾缓冲液 （7∶93）。

3.2 肉豆蔻-8散对心肌缺血再灌注损伤大鼠心肌能量代谢的影响 心肌组织中三磷酸腺苷、二磷酸腺苷、一磷酸腺苷含有量变化直接反映心肌能量代谢水平，心肌能量缺乏是缺血缺氧引起细胞结构和功能异常的根本原因［10］。本实验发现，心肌缺血再灌注损伤大鼠心肌损伤后心肌组织内三磷酸腺苷含有量下降最明显，二磷酸腺苷也显著下降，而一磷酸腺苷显著升高，表明三磷酸腺苷、二磷酸腺苷均发生降解，引起心肌能量代谢障碍，线粒体功能下降；与假手术组比较，肉豆蔻-8散组三磷酸腺苷、一磷酸腺苷含有量均有极显著变化 （P＜0.01），而阳性药组三磷酸腺苷含有量有极显著变化 （P＜0.01），一磷酸腺苷有显著变化（P＜0.05），表明大鼠治疗后心肌细胞损伤仍不可恢复至正常水平；与模型组比较，肉豆蔻-8低剂量组二磷酸腺苷含有量无显著变化 （P＞0.05），三磷酸腺苷、一磷酸腺苷有极显著变化 （P＜0.01），而高、中剂量组及阳性药组三者含有量均有极显著变化 （P＜0.01），其中一磷酸腺苷与三磷酸腺苷比例下降，表明肉豆蔻-8散可增加能量生成，降低能量消耗，并呈剂量依赖性；与阳性药组比较，肉豆蔻-8散低、中剂量组三者含有量有极显著变化 （P＜0.01），而高剂量组二磷酸腺苷、一磷酸腺苷含有量无显著变化（P＞0.05），表明高剂量肉豆蔻-8散中腺苷酸含有量接近阳性药 （复方丹参滴丸）。

4 结论

肉豆蔻-8散可明显增加心肌缺血再灌注损伤大鼠心肌能量储备，缓解心肌组织动力不足，从而起到心肌保护作用，在高剂量下效果最强，其机制可能与促进三磷酸腺苷合成、降低其水解、改善能量代谢有关，可为该制剂临床应用提供理论依据和实验支撑。