一测多评法同时测定参芪二仙片中9种成分

蔡楚兰， 廖 勇

（1.宜昌市优抚医院科教科，湖北宜昌443005；2.三峡大学第二临床医学院，三峡大学附属仁和医院，湖北 宜昌443001）

参芪二仙片收载于中华人民共和国卫生部药品标准 （中药成方制剂第二十册）［1］，由淫羊藿、酒制仙茅、盐制巴戟天、红参、黄芪、当归、盐制黄柏、盐制知母8味药材组成，具有补肾填精、调补冲任、益气养血的功效，临床上主要用于治疗肾虚腰膝酸软、阳痿早泄、遗精、更年期经血不调等症，但其现行质量标准未对方中成分进行定量测定， 仅赵玉华［2］、 杨国振［3］等采用 HPLC 法测定淫羊藿苷含有量，难以有效控制产品质量稳定性和临床疗效一致性。因此，本实验采用一测多评法，以参芪二仙片中淫羊藿苷为内标，计算其与仙茅苷、仙茅苷乙、水晶兰苷、去乙酰基车叶草苷酸、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、宝藿苷Ⅰ的相对校正因子，测定各成分含有量，以期为该制剂质量控制提供参考。

1 材料

Agilent 1100型高效液相色谱仪 （美国安捷伦公司）；BP211D型电子分析天平 （瑞士Mettler-Toledo公司）；KQ2200型超声波清洗器 （昆山市超声仪器有限公司）。参芪二仙片 （批号161002、161103、170107），购于沈阳红药集团股份有限公司。仙茅苷 （110771-201707）、水晶兰苷 （111870-201303）、朝藿定 C （111780-201503）、淫羊藿苷 （110737-201516）、宝藿苷Ⅰ （111852-201603）对照品购于中国食品药品检定研究院；仙茅苷乙 （143601-09-6）对照品购于深圳市佰森生物技术有限公司；去乙酰基车叶草苷酸 （14259-55-3）、朝藿定 A （110623-72-8）、朝藿定B（110623-73-9）对照品购于上海纯优生物科技有限公司。乙腈为色谱纯；其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Kromasil C18色谱柱 （4.6 mm×250 mm， 5 μm）； 流动相乙腈 （A） -0.1% 冰醋酸（B）， 梯度洗脱 （0～16 min， 10.0%A； 16～34 min，10.0%→21.0%A；34～47 min，21.0%→26.0%A；47～58 min，26.0% → 45.0%A；58～65 min，45.0%→10.0%A）； 0～23 min 时在280 nm［4］波长下检测仙茅苷和仙茅苷乙，23～34 min时在235 nm［5-6］波长下检测水晶兰苷和去乙酰基车叶草苷酸，34～65 min 时在 270 nm［2-3，7-11］波长下检测朝藿定 A、 朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、宝藿苷Ⅰ；体积流量0.9 mL／min； 柱温30℃； 进样量10 μL。

2.2 溶液制备

2.2.1 供试品溶液 取片剂10片，除去糖衣后研细，精密称取细粉约0.4 g，置于具塞锥形瓶中，精密加入 70%乙醇 50 mL，称定质量，超声（100 W、40 kHz）30 min，放冷，70%乙醇补足减失的质量，摇匀，过滤，即得。

2.2.2 对照品溶液 精密称取仙茅苷、仙茅苷乙、水晶兰苷、去乙酰基车叶草苷酸、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、宝藿苷Ⅰ对照品适量，70%乙醇制成质量浓度分别为0.432、0.176、0.814、 0.498、 0.262、 0.556、 1.038、 0.642、0.416 mg／mL的贮备液，各精密吸取2.5 mL，置于50 mL量瓶中，70%乙醇稀释至刻度，制成质量浓度分别为21.6、8.8、40.7、24.9、 13.1、27.8、51.9、 32.1、 20.8 μg／mL 的溶液， 即得。

2.2.3 阴性样品溶液 按片剂质量标准项下的处方和工艺，分别制成不含仙茅、巴戟天、淫羊藿的阴性样品，按 “2.2.1”项下方法制备，即得。

2.3 系统适用性考察与专属性试验 精密吸取供试品、对照品、阴性样品溶液适量，在 “2.1”项色谱条件下进样测定，结果见图1。由图可知，各成分与其相邻色谱峰的分离度均大于1.5，理论塔板数按各色谱峰计均大于3 500，阴性无干扰。

2.4 线性关系考察 精密吸取 “2.2.2”项下对照品溶液各 2.0 mL，置于同一20 mL量瓶中，70%乙醇定容至刻度，摇匀，作为混标液A，精密吸取适量，70%乙醇分别稀释 2、4、8、16、20倍，作为混标液B、C、D、E、F，精密吸取适量，在 “2.1”项色谱条件下进样测定。以成分质量浓度为横坐标 （X），峰面积为纵坐标 （Y）进行回归，结果见表1，可知各成分在各自范围内线性关系良好。

表1 各成分线性关系Tab.1 Linear relationships of various constituents

2.5 方法学考察

图1 各成分HPLC色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.5.1 精密度试验 取 “2.2.3”项下对照品溶液，在 “2.1”项色谱条件下进样测定6次，记录峰面积，考察日内精密度；连续进样6 d，每天1次，考察日间精密度。结果，仙茅苷、仙茅苷乙、水晶兰苷、去乙酰基车叶草苷酸、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、宝藿苷Ⅰ日内峰面积RSD分别为 0.91%、1.13%、0.66%、0.80%、1.09%、0.87%、0.59%、0.64%、0.93%，日间峰面积 RSD分别为 1.08%、1.27%、0.74%、0.85%、1.03%、0.99%、0.57%、0.72%、1.01%，表明该方法精密度良好。

2.5.2 重复性试验 取同一批片剂，按 “2.2.1”项下方法制备供试品溶液6份，在 “2.1”项色谱条件下进样测定，测得仙茅苷、仙茅苷乙、水晶兰苷、去乙酰基车叶草苷酸、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、宝藿苷Ⅰ含有量RSD分别为 0.32%、 1.54%、 1.16%、 1.23%、 0.49%、1.30%、1.01%、0.76%、1.36%，表明该方法重复性良好。

2.5.3 稳定性试验 取同一批片剂，按 “2.2.1”项下方法制备供试品溶液，室温下于0、2、4、6、8、12 h在 “2.1”项色谱条件下进样测定，测得仙茅苷、仙茅苷乙、水晶兰苷、去乙酰基车叶草苷酸、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、宝藿苷Ⅰ峰面积 RSD分别为 0.88%、1.15%、0.69%、 0.74%、 1.06%、 0.85%、 0.57%、0.62%、1.09%，表明溶液在12 h内稳定性良好。

2.5.4 加样回收率试验 取含有量已知的片剂适量，除去糖衣后研细，精密称取细粉6份，每份约0.2 g，置于 50 mL量瓶中，精密加入仙茅苷（0.257 mg／mL）、 仙茅苷乙 （0.098 mg／mL）、 水晶兰苷 （0.553 mg／mL）、去乙酰基车叶草苷酸（0.287 mg／mL）、 朝藿定 A （0.151 mg／mL）、 朝藿定 B （0.331 mg／mL）、 淫羊藿苷 （0.394 mg／mL）、宝藿苷Ⅰ （0.227 mg／mL） 对照品溶液各1.0 mL，以及朝藿定 C（0.353 mg／mL）对照品溶液2.0 mL，按 “2.2.3”项下方法制备供试品溶液，在 “2.1”项色谱条件下进样测定，计算回收率。结果，仙茅苷、仙茅苷乙、水晶兰苷、去乙酰基车叶草苷酸、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、宝藿苷Ⅰ平均加样回收率分别为98.63%、97.13%、99.41%、98.38%、97.46%、98.49%、100.05%、 99.19%、 97.70%， RSD 分别为1.18%、 1.44%、 0.86%、 1.25%、 1.52%、0.94%、0.85%、1.03%、1.32%。

2.6 相对校正因子计算 精密吸取 “2.4”项下混标液适量，在 “2.1”项色谱条件下进样测定，以淫羊藿苷为内标，计算其他8种成分相对校正因子 fk／s， 公式为 fk／s＝fk／fs＝ （WkAs） ／（WsAk） （Wk为内标质量浓度，Ak为内标峰面积，Ws为其他成分质量浓度，As为其他成分峰面积），结果见表2。

表2 各成分相对校正因子Tab.2 Relative correction factors of various constituents

2.7 各因素对相对校正因子的影响

2.7.1 仪器、色谱柱 取 “2.2.3”项下对照品溶液适量，在 “2.1”项色谱条件下进样测定，考察Agilent 1100、LC-20AT色谱仪和 Kromasil C18、Agilent TC-C18、Diamonsil C18色谱柱对相对校正因子的影响，结果见表3，可知均无明显影响。

表3 不同仪器、色谱柱对相对校正因子的影响Tab.3 Effects of different instruments and columns on relative correction factors

2.7.2 体积流量 取 “2.2.3”项下对照品溶液适量，在 “2.1”项色谱条件下进样测定，考察体积流量0.8、0.9、1.0 mL／min对相对校正因子的影响，结果见表4，可知均无明显影响。

表4 不同体积流量对相对校正因子的影响Tab.4 Effects of different volume flow rates on relative correction factors

2.7.3 柱温 取 “2.2.3”项下对照品溶液适量，在 “2.1”项色谱条件下进样测定，考察柱温25、30、35℃对相对校正因子的影响，结果见表5，可知均无明显影响。

表5 不同柱温对相对校正因子的影响Tab.5 Effects of different column temperatures on relative correction factors

2.8 色谱峰定位 本实验采用相对保留值法对待测成分色谱峰进行定位，结果见表6，可知不同仪器、色谱柱下各成分相对保留值无明显差异。

表6 各成分相对保留值Tab.6 Relative retention values of various constituents

2.9 样品含有量测定 取3批片剂 （批号161002、161103、 170107） 适量， 按 “2.2.1” 项下方法制备供试品溶液，在 “2.1”项色谱条件下进样测定，分别采用外标法和一测多评法计算含有量，结果见表7，可知2种方法所得结果无明显差异，相对平均偏差 （RAD）均＜2%。

表7 各成分含有量测定结果 （mg／g）Tab.7 Results of content determination of various constituents （mg／g）

3 讨论

3.1 供试品溶液制备方法选择 本实验考察了提取溶剂 （50% 乙醇［2-3，7，9-12］、 70% 乙醇［5，13］、 乙醇、50% 甲醇、 甲醇［4，10］）、 提取方式 （超声［2，5，7，9-10］、加热回流［3-4，8］） 对待测成分提取效果的影响，发现以70%乙醇为提取溶剂时综合提取效率最佳，而超声、加热回流提取所得结果差异不大，但前者更方便稳定。然后，又考察了提取时间 （15、30、60 min）对提取效率的影响，同时对超声功率、频率也进行了不断摸索。最终确定，供试品溶液制备方法为以70%乙醇为提取溶剂，超声 （100 W、40 kHz） 30 min。

3.2 流动相选择 本实验以待测成分峰形及分离效果、色谱图基线平稳情况、出峰时间为指标，考察了 乙腈-水［2-3，7，9-11，13］、 甲 醇-0.1% 磷 酸［5，10］、 乙腈-0.1%冰醋酸流动相体系［4，8］， 并对流动相洗脱比例进行了不断摸索。最终确定，以乙腈-0.1%冰醋酸为流动相，在 “2.1”项色谱条件下梯度洗脱。

4 结论

中成药复方制剂具有多成分、多靶点、协同作用的特点，单一成分难以实现对其整体质量的评价和控制，故多指标质量控制已成为的必然趋势，但它又存在对照品使用量大、单体不稳定或价格昂贵、检验成本高等问题。一测多评法根据中药不同有效成分之间存在的内在函数关系和比例，通过测定某1种性质稳定、对照品价廉的成分来实现多种成分的同步测定，可大大降低检验成本，提高检测结果准确性。本实验采用该方法同时测定参芪二仙片中仙茅苷、仙茅苷乙、水晶兰苷、去乙酰基车叶草苷酸、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、宝藿苷Ⅰ的含有量，所建立的相对校正因子可信度较高，而且该方法简便准确，可为提高该制剂质量标准提供有力的数据支持。