益气通脉胶囊质量标准的研究

孔 燕， 王 健

（扬州市食品药品检验检测中心，江苏扬州225009）

益气通脉胶囊为宝应县中医医院经验方，由西洋参、三七、黄精、川芎、赤芍等8味药材组成，功效益气养阴、活血通脉，用于气阴不足兼血瘀症所致头昏、头晕、胸闷、胸痛，但该方并无明确详细的质量标准。因此，本实验通过查阅相关文献和反复摸索，制定三七、川芎的显微鉴别方法，确定川芎、赤芍、西洋参、三七的TLC定性鉴别方法［1］，并通过HPLC法测定西洋参、三七中三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1的含有量［2］， 以期控制该制剂质量［3］。

1 材料

BX51光学显微镜、3X Optical Zoom数码相机（日本 Olympus公司）；MS204S电子天平 （瑞士Mettler-Toledo公司）；HH-4数显恒温水浴锅 （常州国华电器有限公司）；TLC Visualizer薄层成像系统 （瑞士Camag公司）；硅胶G薄层板、高效硅胶G薄层板 （青岛海洋化工厂）；Agilent 1200高效液相色谱仪 （美国安捷伦公司）。乙腈为色谱纯［4］；其他试剂均为分析纯；水为纯化水。

川芎 （批号120918-201612）对照药材及芍药苷 （批号 110736-201741）、 三七皂苷 R1（批号110745-201619）、 人参皂苷 Rg1（批号 110703-201731）、人参皂苷Re（批号110754-201626）、人参皂苷 Rb1（批号110704-201625）、拟人参皂苷（批号841-9903）对照品均购于中国食品药品检定研究院。

3批益气通脉胶囊来自宝应县中医医院制剂室， 批号170502、 170529、 170619， 0.3 g／粒， 10粒／板，3板／盒。缺川芎、赤芍、西洋参、三七阴性样品 （同时缺西洋参、三七的为阴性对照），来自宝应县中医医院制剂室。

2 方法与结果

2.1 显微鉴别 图1～2显示，三七中树脂道碎片含黄色分泌物［7］；川芎中油室大多已破碎，偶可见油室碎片，分泌细胞壁薄，含有较多的油滴［7］，3批样品显微特征均稳定，易于鉴别。

图1 三七显微鉴别图Fig.1 Image for microscopic identification of Notoginseng Radix et Rhizoma

2.2 TLC定性鉴别

2.2.1 川芎 取本品内容物2 g，加25 mL乙醚轻摇，回流15 min，过滤，蒸干，残渣加1 mL乙酸乙酯溶解，作为供试品溶液［8-9］；取对照药材1 g，同法制成相应溶液［3，7］；取阴性样品适量，同法制成相应溶液，吸取上述3种溶液各5 μL，点于同一硅 胶 G 薄 层 板 上［6，10］， 以 正 己 烷-乙 酸 乙 酯（3∶1）为展开剂，展开缸中预平衡15 min，上行展开，展距 9 cm，取出，晾干，置于紫外灯（365 nm） 下检视［4，11］， 结果见图 3。 由图可知，供试品色谱中在与对照药材相应位置上显相同颜色荧光斑点［12］， 阴性无干扰［13］。

图2 川芎显微鉴别图Fig.2 Image for microscopic identification of Chuanxiong Rhizoma

图3 川芎TLC色谱图Fig.3 TLC chromatogram of Chuanxiong Rhizoma

2.2.2 赤芍 取本品内容物2 g，加25 mL乙醇，轻摇，超声15 min，过滤，蒸干，残渣加1 mL乙醇溶解，作为供试品溶液［4］；取芍药苷对照品适量，甲醇制成每1 mL含1 mg该成分的对照品溶液［2］；取阴性样品适量，同法制成相应溶液，吸取上述3种溶液各8 μL，点于同一硅胶G薄层板上［2］， 以氯仿-乙酸乙酯-甲醇-甲酸 （40 ∶5 ∶20 ∶0.5）为展开剂，展开缸中预平衡15 min，上行展开，展距9 cm，取出，晾干，再喷以5%香草醛硫酸溶液［7-8］， 105 ℃下加热至斑点显色清晰［11］， 置于日光下检视，结果见图4。由图可知，供试品色谱在与对照品相应位置上显相同颜色斑点［2］，阴性无干扰。

2.2.3 西洋参、三七 取本品内容物2 g，加25 mL甲醇轻摇，回流30 min，滤过，滤液蒸干，残渣加20 mL水溶解，加水饱和正丁醇振摇提取2次［5］， 每次 25 mL， 合并提取液［14-15］， 正丁醇饱和水洗涤 2 次［2-3］， 每次 10 mL， 分取正丁醇液［7，9］，蒸干，残渣加1 mL甲醇溶解，作为供试品溶液［4，8］； 取拟人参皂苷 F11、 人参皂苷 Rb1、 人参皂苷Re、人参皂苷Rg1、三七皂苷R1对照品适量，甲醇制成每l mL各含2 mg上述成分的对照品溶液；取阴性对照适量，同法制成相应溶液，吸取上述3种溶液各 5 μL，点于同一硅胶 G薄层板上［4，11］， 以三氯甲烷-无水乙醇-水 （20 ∶20 ∶2）为展开剂，展开缸中预平衡15 min，上行展开，展距9 cm，取出，晾干，再喷以10%硫酸乙醇溶液［11］， 105 ℃下加热至斑点显色清晰［4，15］， 分别置于日光、紫外光灯 （365 nm）下检视，结果见图5。由图可知，供试品色谱在与对照品相应位置上显相同颜色斑点或荧光斑点［2，10］，阴性无干扰。

2.3 HPLC含有量测定

2.3.1 色谱条件和系统适应性试验 Inertsil®ODS-SP 色谱柱 （5 μm， 4.6 mm×250 mm）； 流动相乙腈 （A）-水 （B）， 梯度洗脱， 程序见表 1；体积流量 1.0 mL／min；柱温 28℃；检测波长203 nm；进样量10 μL，色谱图见图6。由图可知，各成分分离度良好，阴性无干扰，理论塔板数按人参皂苷Rb1计应不低于4 000。

表1 梯度洗脱程序Tab.1 Gradient elution programs

图5 三七、西洋参TLC色谱图Fig.5 TLC chromatograms of Notoginseng Radix et Rhizoma and Panacis quinquefolii Radix

2.3.2 溶液制备

2.3.2.1 对照品溶液 精密称取各对照品适量，置于25 mL量瓶中，甲醇溶解定容至刻度，摇匀，制成分别含三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、 人 参 皂 苷 Rb1317.12、 552.32、 646.72、561.28 μg／mL 的溶液， 即得。

2.3.2.2 供试品溶液 取质量差异项下本品内容物，研细，混匀，精密称取约0.5 g，置于具塞锥形瓶中，精密加入25 mL甲醇，称定质量，静置1 h，80℃水浴回流2 h，放冷，甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.3.3 线性关系考察 精密量取对照品溶液0.5、1、2、3、4、5、6 mL，置于10 mL量瓶中，甲醇稀释定容至刻度， 分别精密量取 10 μL［4］， 在“2.3.1”项色谱条件下进样测定［10］。以溶液质量浓度为横坐标 （X）， 峰面积为纵坐标 （Y）［16］进行回归，结果见表2，可知各成分在各自范围内线性关系良好。

图6 各成分HPLC色谱图Fig.6 HPLC chromatograms of various constituents

表2 各成分线性关系Tab.2 Linear relationships of various constituents

然后，甲醇多次稀释对照品溶液，以信噪比S／N＝3为检测限，S／N＝10为定量限。结果，三七皂苷R1检测限、 定量限分别为 2.448、 8.606 μg／mL，人参皂苷Rg1分别为0.628、 3.580 μg／mL， 人参皂苷 Re 分别为 3.720、 13.953 μg／mL、 人参皂苷Rb1分别为 0.102、 27.151 μg／mL。

2.3.4 精密度试验 精密吸取对照品溶液各10 μL， 在 “2.3.1” 项色谱条件下进样测定 6次［16］， 测得三七皂苷 R1、 人参皂苷 Rg1、 人参皂苷Re、人参皂苷Rb1峰面积RSD［17］分别为1.4%、1.2%、1.2%、0.9%，表明仪器精密度良好。

2.3.5 稳定性试验 精密称取批号170502样品0.5 g，按 “2.3.2.2”项下方法制备供试品溶液，于0、 4、 8、 12、 24、 48 h在 “2.3.1” 项色谱条件下进样10 μL测定［18］，测得三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1峰面积RSD分别为1.6%、1.5%、1.5%、0.9%，表明溶液在48 h内稳定性良好。

2.3.6 重复性试验 精密称取批号170502样品6份，每份0.5 g，按 “2.3.2”项下方法制备供试品溶液，在 “2.3.1” 项色谱条件下进样测定［19］，测得三七皂苷R1、人参皂苷 Rg1、人参皂苷 Re、人参皂苷Rb1含有量RSD分别为1.4%、1.5%、13%、0.8%，表明该方法重复性较好。

2.3.7 加样回收率试验 精密称取批号170529样品6份，每份0.25 g，精密加入含三七皂苷 R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb11 982、4 054、 3 564、 3 784 μg／mL 的对照品溶液 0.2 mL及甲醇24.8 mL，按 “2.3.2”项下方法制备供试品溶液，在 “2.3.1”项色谱条件下进样测定，计算回收率，结果见表3。

表3 各成分加样回收率试验结果 （n＝6）Tab.3 Results of recovery tests for various constituents（n＝6）

2.3.8 样品含有量测定 将 3批样品［13］按“2.3.2”项下方法制备供试品溶液，在 “2.3.1”项色谱条件下进样测定［9］，计算含有量，结果见表4。然后，按三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1平均含有量的80%设限，分别为0.30、1.60、1.30、3.00 mg／粒，拟规定样品中［5，18］含西洋参、三七量以各成分总含有量计，不得少于6.0 mg／粒。

表4 各成分含有量测定结果 （n＝3）Tab.4 Results of content determination of various constituents（n＝3）

3 讨论

3.1 TLC条件筛选 川芎的TLC条件参照2015年版 《中国药典》，采用乙醚回流提取作为提取方法；比较了硅胶G预制薄层板、硅胶H预制薄层板、高效硅胶G预制薄层板 （青岛海洋化工厂）上，发现高效硅胶G板虽然斑点较清晰，但Rf值相对其他2种板稍逊，综合考虑选择硅胶G板作为点样薄层板；考察了不同展开系统，最终采用正己烷-乙酸乙酯 （3∶1），此时斑点清晰，分离度好，Rf值适宜； 比较了点样2、5、 8、10 μL， 发现点样5 μL时斑点清晰可见，分离度良好，无拖尾现象；样品放置24 h后再点样，发现斑点仍清晰可见，表明稳定性较好；温度、湿度对川芎TLC定性鉴别的影响不显著，两者分别在15～22℃、38%～65%范围内时薄层层析结果稳定，斑点清晰。

赤芍的TLC条件参照2015年版 《中国药典》，采用乙醇超声作为提取方法；比较了硅胶G预制薄层板 （青岛海洋化工厂、德国MN公司）、高效硅胶G预制薄层板 （青岛海洋化工厂），发现均能得到较好分离，主斑点清晰，其中MN硅胶G板的斑点清晰度优于青岛海洋硅胶G板，但Rf值较低，而后者虽然斑点略散，但Rf值较适中，故选择青岛海洋硅胶G板作为点样薄层板；比较了不同展开系统，最终采用三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（40∶5∶20∶0.5），此时斑点清晰，分离度好，Rf值适宜； 比较了点样2、5、8、10 μL， 发现点样8 μL斑点清晰可见，分离度良好，无拖尾现象；样品放置24 h后点样，发现斑点仍清晰可见，表明稳定性较好；温度、湿度对赤芍TLC定性鉴别的影响不显著，两者分别在15～22℃、38%～65%范围内时薄层层析结果稳定，斑点清晰。

西洋参、三七的TLC条件参考了2015年版《中国药典》，由于前者含有拟人参皂苷F11，为其特异性成分，同时2种药材中共有成分较多，以三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1相对含有量较高，故选择上述5种成分进行实验；考察了不同提取方法，最终采用甲醇回流蒸干→加水溶解→正丁醇萃取→水洗作为提取方法；比较了硅胶G预制薄层板、硅胶H预制薄层板、高效硅胶G预制薄层板 （青岛海洋化工厂），发现对照品在硅胶G、硅胶H板上均不能完全分离，而在高效硅胶G板上有较好分离，主斑点清晰，故选择其作为点样薄层板；比较了不同展开系统，最终采用三氯甲烷-无水乙醇-水 （20∶20∶2）；比较了点样2、 5、 8、 10 μL， 发现点样 5 μL时斑点清晰可见，分离度良好，无拖尾现象；样品放置24 h后点样，发现斑点然清晰可见，表明稳定性较好。温度、湿度对人参皂苷类成分TLC定性鉴别的影响较大，两者分别在20℃以下、低于50%时薄层层析结果稳定，斑点清晰。

3.2 HPLC条件筛选 参考2015年版 《中国药典》，分别放置过夜、1 h后再回流提取，发现两者无明显区别，故确定提取方法为取样后加甲醇静置1 h，80℃水浴下回流2 h，此时供试品溶液提取充分，简便易行；以出峰数、相邻对照品色谱峰之间的分离度为主要指标，优化色谱柱、柱温、流动相、梯度洗脱程序、检测波长，最终确定“2.3.1” 项下色谱条件［20］。