灵芝多糖结构特征及药理作用的研究进展

王 颖， 魏佳韵， 吴思佳， 章春豪， 王兴亚

（浙江中医药大学药学院，浙江杭州311400）

灵芝为担子菌纲多孔菌科真菌，为我国名贵传统中药材，应用源远流长，是滋补强壮、扶正固本的珍品，其药用研究已有2 000多年的历史，早期以研究灵芝子实体、菌丝体及孢子粉等有效成分及其结构鉴定为主［1-3］。研究表明，灵芝主要活性物质有多糖、三萜、甾醇、凝集素、蛋白质等，其中灵芝多糖是其关键药效成分，其化学结构和组成多样，而结构上的差异对其药理作用具有一定的影响。随着新技术发展，越来越多的研究深入关注灵芝多糖药理活性，发现该成分具有免疫调节、抗肿瘤、降血糖、降血脂、解毒、抗病毒、抗细菌、抗辐射等广泛作用［4-5］。为近一步明确灵芝多糖药理活性，许多研究在其活性作用分子机制方面开展了诸多积极的探索，同时也取得了一些有益的进展，但近年来国内外缺少对灵芝多糖相关研究较为全面的综述报道。因此，本文对灵芝多糖结构特征及药理作用进行综述，在总结其研究进展的基础上对未来研究方向提出展望。

1 组成结构及其构效关系

人们已从灵芝子实体、菌丝体、孢子粉、发酵液中提取分离出不同种类的多糖［6-8］，它们是由单一或多种单糖聚合而成的高分子化合物。由于灵芝的种类、产地、分离提取方法各异，灵芝多糖在化学结构和组成上有巨大的多样性，结构上细微差别可影响其特异性的生物功能，故完整描述其化学结构对研究其生物活性至关重要。

1.1 组成结构 通过热水浸提法、乙醇沉淀法、Sevag法、色谱法等方法获得的灵芝多糖主要由葡聚糖、糖蛋白、水溶性杂多糖组成［3］，其中各组分由葡萄糖、甘露糖、半乳糖、岩藻糖、木糖和阿拉伯糖等单糖以不同比例、糖苷键、肽键结合［9-10］。

一般来说，多糖结构特征包括分子量大小、单糖组成、糖苷键构型、分支度、三级结构等［5］，但产地、提取部位、分离提取方法不同，所得多糖组成也有所差异，如采用热水浸提法提取同样产自中国的灵芝子实体、菌丝体、孢子粉中多糖时发现，子实体中多糖是以β-糖苷键连接的、相对分子量0.6 kDa的杂聚糖，由鼠李糖、木糖、果糖、半乳糖、甘露糖、葡萄糖6种单糖构成［11］；菌丝体含有的多糖是以α-D-Glc （1→6）， α-D-Glc， α-D-Man为主链的相对分子量为3.5 kDa的杂多糖，单糖组成为鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖［12-13］；孢子粉含有的多糖以β-（1→6）糖苷键连接的葡聚糖为主，相对分子量 103 kDa。Miyazaki等［14］也采用热水浸提法提取产自日本的灵芝子实体中多糖， 发现其以 β-D-（1→3）、 β-D-（1→6）、（1→4） -α-、β-糖苷键相连的分枝杂聚糖为主，由葡萄糖、木糖、阿拉伯糖组成，相对分子量40 kDa。此外，不同提取方法也是多糖结构多样性的重要原因，如产自中国的灵芝子实体经碱抽提法得到的灵芝多糖是以β-1，3糖苷键连接的葡聚糖，相对分子量约4.0 kDa［15］。见表1。

表1 灵芝多糖结构特征和生物活性

续表1

1.2 生物活性影响因素 由于产地、提取部位、提取方法等不同，灵芝多糖化学结构差异很大，对其生物活性具有很大影响，尤其是主链结构。大量体外抗氧化试验证实，从灵芝中分离提取出的同聚糖和杂聚糖具有显著抗氧化活性［6，15］， 两者主要糖苷键为 β- （1-3）、 （1-4）、 （1-6），Sone［1］、 Wang等［24］对多糖抗肿瘤活性与其结构关系进行了研究，均发现富含 （1→3）-β-D-葡聚糖主链结构的多糖抗肿瘤活性最强， 但 Guo［21］、 Bao 等［23］发现富含由 β-或 β-D-（1→3）糖苷键连接而成的葡聚糖的多糖具有较好免疫调节作用。

多糖相对分子量也可影响生物活性，Ma等［7］研究表明分离组分 GLP1 （＞10 kDa）、 GLP2 （8～10 kDa）、 GLP3（2.5～8 kDa）、 GLP4 （＜2.5 kDa） 抗氧化活性和抑制肿瘤细胞增殖能力与其分子量成正比。多糖生物活性还可能与其溶解度有关，Liu等［25］报道经过羟丙基化改性后获得了衍生物H-GLP，水溶性更高 （＞50 mg／mL），自由基清除活性也更强。Xu等［26］发现，甲基化修饰后多糖抗氧化活性较未修饰时显著提高，表明化学基团修饰也能影响其生物活性。另外，多糖生物活性还与黏度、分支度等有关［22］。具体见表1。

2 药理作用

2.1 免疫调节 Lin 等［27］研究了具有 （1→6） -β-D-葡聚糖分支结构的灵芝多糖对人单核细胞来源的树突状细胞的影响，发现多糖可能通过NF-κB、p38MAPK信号通路快速有效地诱导人树突状细胞的活化和成熟；另一项研究发现，从破壁灵芝孢子粉热水提取物中分离纯化的相对分子量512.5 kDa的多糖GL-BSP可显著提高自然杀伤细胞 （NK细胞）活力，增强巨噬细胞的吞噬作用［28］。

灵芝多糖对细胞免疫功能的影响是其免疫调节作用的重要方面，也一直受到研究者的关注，Zhang等［16］利用细胞免疫-迟发型变态反应 （DTH）实验研究了灵芝子实体水提物多糖的免疫调节作用，发现与对照组相比高剂量（2.25 g／kg） 组显著提高足趾肿胀度 （P＜0.01）； 还有研究发现多糖可促进S180荷瘤小鼠体内脾淋巴细胞增殖，增加T淋巴细胞CD4＋、CD8＋比例［28］。此外，该成分还通过明显增加抗体生成和增强血清中IFN-γ、TNF-α、NO水平，从而发挥其调节体液免疫和促进免疫细胞因子产生的作用［16，28-29］。

长期重负荷运动能够引起机体免疫应答减弱。Shi等［30］研究了多糖对长期重负荷运动小鼠的免疫调节作用，发现它可显著增加外周血白细胞、中性粒细胞绝对值、巨噬细胞吞噬活性、血清凝集效价及空斑形成细胞数量，改善非特异性和特异性免疫应答。

综上所述，灵芝多糖通过激活树突状细胞和巨噬细胞分化及成熟，诱导自然杀伤细胞，调节T、B淋巴细胞的增殖与免疫应答、促进免疫细胞因子生成，用于发挥提高机体非特异性和特异性免疫的作用［31］。

2.2 抗肿瘤 灵芝多糖的抗肿瘤作用最初是在小鼠S-180肉瘤细胞中发现的［1，14］。除了动物、细胞模型实验外，灵芝多糖也被用于临床抗肿瘤治疗，该活性与激活宿主免疫调节机制相关［32-33］。

2.2.1 动物、细胞模型实验 在体内动物模型中，多糖已经显示出通过增强免疫而抑制肿瘤发展的作用［34-37］。Sun等［38］从灵芝热水提取物中分离出一种以β-糖苷键连接的相对分子量584.9 kDa的杂多糖，可通过增加B16F10黑色素瘤细胞表面H-2Db（MHCⅠ类抗原）和B7-1、B7-2（协同刺激分子）表达来促进淋巴细胞活化与增殖及IFN-γ的分泌，进而抑制B16F10细胞生长。从破壁灵芝孢子粉中分离纯化的多糖GL-BSP （50、100和200 mg／kg） 可通过刺激NK细胞、T细胞和巨噬细胞激活机体免疫应答，抑制BALB／c小鼠中S180肉瘤的生长［28］。另外，在肝癌荷瘤小鼠中，灵芝多糖通过增大效应T细胞／调节性T细胞比例，消除调节性T细胞对效应T细胞增殖的抑制及增加IL-2的分泌而明显抑制肿瘤生长［39］。

Liang等［36］在研究水溶性灵芝多糖 （α-糖苷键连接）对人结肠癌细胞HCT116的作用时发现，它可诱导HCT116细胞凋亡，并与线粒体、MAPK信号通路密切相关。Yang等［40］报道，灵芝多糖可通过激活P38、JNK／MAPK途径诱导HL-60急性髓细胞性白血病细胞周期阻滞和凋亡。课题组最新研究显示，破壁灵芝孢子粉中提取的多糖能以时间、剂量依赖方式抑制HCT116细胞增殖，将细胞周期阻滞在G2／M期，并诱导细胞凋亡［41］；可显著抑制裸鼠HCT116移植瘤发生发展，并缓解5-氟尿嘧啶所引起的小鼠体质量明显降低；水提物抗肿瘤作用可能与激活促凋亡基因NAG-1有关［41］。

2.2.2 临床应用 近年来，肿瘤免疫治疗取得了显著成绩，但治疗方案不成熟，而且其发病机制的复杂性使得单用该方法并不能达到理想的抗癌效果，研究表明，免疫治疗辅助化疗可获得较好的效果［42］。一项由373名癌症患者组成的5个随机对照试验Meta分析显示，灵芝可显著增加外周血CD3、CD4、CD8水平，提高白细胞、NK细胞活性及CD4／CD8比值，从而使化疗／放疗效果更好，生活质量也相对提高［43］。 Gao等［44］研究了 Ganopoly （灵芝多糖提取物）对晚期癌症患者的作用，34名晚期癌症患者只接受1 800 mg剂量治疗12周，每天3次，发现它可显著增加血清IL-2、IL-6、IFN-γ平均浓度及自然杀伤细胞活性，并显著提高CD56＋细胞的绝对数量及患者PHA反应。最近，Sun等［45］考察了多糖对肺癌患者的治疗作用，发现它可拮抗肺癌患者血浆对淋巴细胞的增殖和活化的抑制作用。具体见图1。

图1 灵芝多糖抗肿瘤作用的免疫调节机制

2.3 抗氧化 生物体在代谢过程中会产生各种氧自由基，而过多自由基及其诱导的氧化反应会导致器官组织损伤，并与机体衰老、炎症和心脑血管疾病等病理过程密切相关，许多中药多糖都具有抗氧化活性［46-48］。体外试验显示，灵芝多糖可有效清除羟自由基、DPPH自由基、ABTS自由基、超氧自由基，抑制脂质过氧化物的生成［8，49］；体内试验中， Li等［11］、 Zhao 等［50］分别以 γ-射线、 运动诱导氧化应激小鼠模型，发现多糖呈剂量依赖性增加SOD、CAT、GSH-Px活性，并显著降低MDA水平。

另外，灵芝多糖还具有抗衰老作用。Li等［51］观察了多糖对D-氨基半乳糖致衰老小鼠的作用，发现它通过提高皮肤组织SOD水平增加表皮和真皮厚度，改善皮肤组织结构来延缓皮肤衰老。多糖GL-PS（纯度98%）可通过消除中波紫外线UVB诱导的活性氧ROS，保护人皮肤成纤维细胞抵抗光老化［52］。

2.4 降血糖及抗糖尿病及其并发症 研究表明，中药多糖具有较好的降血糖功效，并且作用温和，无毒副作用，具有巨大开发潜能［53-56］。灵芝多糖在控制血糖、提高胰岛素敏感性、增强胰岛β细胞功能、改善糖尿病并发症方面有较好的效果，Hikino等［57］最早研究发现它可提高小鼠血浆胰岛素水平，降低血浆糖水平，随后被证明是通过调节糖代谢相关酶活性、抗氧化和降低β细胞凋亡等控制血糖浓度［58-60］。最近研究发现，它还可能通过调节炎症细胞因子及肠道菌群组成来改善小鼠的胰岛素敏感性［61-62］。具体见表2。

临床上关于灵芝多糖治疗胰岛素抵抗和糖尿病的报道较少，Gao等［73］研究了多糖提取物 （商品名ganopoly）对71名2型糖尿病患者的治疗效果，发现1 800 mg剂量（每日3次，口服）治疗12周后与安慰剂相比，能更显著降低患者空腹和餐后糖化血红蛋白、血糖水平，特别是餐后血糖由服药前的 13.6 mmol／L 降至 11.8 mmol／L （P＜0.05），而且空腹和餐后2 h胰岛素显著升高。

表2 灵芝多糖降血糖及抗糖尿病功效

综上所述，灵芝多糖在动物模型、临床试验中均显示出较好的抗糖尿病作用，机制见图2。但动物模型单一，链脲佐菌素诱导的糖尿病模型为主，缺乏体外细胞模型及临床研究，故今后还需要进一步揭示该成分调控糖代谢和胰岛素抵抗的具体分子机制。

图2 灵芝多糖抗糖尿病机制

2.5 抗炎 在体外细胞实验中发现，灵芝多糖 （5、10、20、 50、 100 μg／mL） 处理RAW264.7细胞后， 可呈剂量依赖性地降低促炎因子iNOS、IL-1、TNF-α的表达，而抗炎因子IL-10水平明显增加，是通过抑制 NF-κB、JNK1／2、P38MAPKs活性实现的［74］。在脂多糖刺激的人主动脉平滑肌细胞中，灵芝多糖 （10 μg／mL） 通过抑制ERK磷酸化、NF-κB活性、TLR4信号通路明显降低IL-1β表达。动物实验亦表明，每天口服60 mg／kg灵芝多糖可降低小鼠胸主动脉中IL-1β表达［75］。最近研究发现，灵芝多糖GLPss58能明显抑制L-选择素与其配体结合，而白细胞炎症反应的第一步就是两者结合，这对抑制炎症反应有重要意义［76］。

2.6 抗菌 灵芝多糖可抑制细菌生长或直接杀死致病菌［77］， 但相关报道较少。 Bai等［78］通过纸片琼脂法对提取出的粗多糖进行抑菌试验，发现它对植物病原菌中的胡萝卜欧氏菌、指状青霉菌的抑菌圈直径分别为8、6 mm，而对灰葡萄孢几乎无抑制作用；食品有害菌中的枯草芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌也被模型抑制，抑菌圈直径分别为11.7、18.3 mm，但对大肠杆菌作用相对较弱，对黑曲霉和黑根霉几乎无作用。随后，Mahendran等［79］也发现多糖EPS能明显抑制蜡状芽孢杆菌的生长。

2.7 其他 Zhang等［80］研究了提取自灵芝菌丝体中的多糖对卡介菌BCG诱导的免疫性肝损伤小鼠的作用，发现它可明显改善肝肿大，减少ALT释放及NO产生，有着肝保护作用。在132名神经衰弱患者组成的随机双盲对照试验中发现，多糖提取物Ganopoly（1 800 mg，每日3次，疗程8周）可改善临床症状，临床整体印象严重度、疲劳感得分分别较基础值降低15.5%、28.3%，健康状况评分提高38.7%［81］。 Ouyang 等［82］研究发现， 灵芝粗多糖 （100～200 mg／kg）处理后化疗相关性疲劳小鼠血肌酐和尿素氮降低，可能通过减少肾毒素来改善症状。Zhao等［83］发现，灵芝多糖可减少钴60-γ射线辐射小鼠DNA单键断裂和微核频率，提高防辐射作用。同时，灵芝多糖还可促进肠上皮细胞的损伤修复［84］。

3 展望

近几十年来，国内外对灵芝多糖提取分离、纯化、结构鉴定、药理作用、保健功能等方面进行了大量研究，发现该成分具有免疫调节、抗肿瘤、抗氧化、降血糖和抗糖尿病、抗炎、抗菌等多种药理活性，在药用资源、治疗佐剂、保健食品添加剂方面具有巨大开发前途。但灵芝多糖组成结构的复杂性及分离分析方法的限制，其种类、分子结构、构效关系、作用机制、最佳给药剂量和途径也仍未完全明确，临床相关研究也十分缺乏。因此，进一步探明灵芝多糖化学结构，深入研究其药理活性，寻找其物质基础、抗病机制及潜在保健药物功能，仍是今后研究的基础。同时，利用3D技术等新兴技术，对灵芝多糖结构进行修饰以增强其免疫和抑癌活性，提高临床应用也是重要研究方向。

研究表明，灵芝孢子粉有效成分含有量及药用价值远高于灵芝其他部位［85-86］，破壁后更明显［87-88］，故研究去壁或破壁灵芝孢子粉多糖的生理功能也是今后一个重要的研究点。随着人们健康意识的逐步提高，以灵芝多糖为主要成分的保健品和药品具有广阔的发展空间和巨大的商业价值，相信随着对该成分药理活性及构效关系的深入研究，灵芝作为拥有数千年药用历史的传统珍贵中药材必将在抗衰老、抗癌症等方面作出更大贡献。