盆腔器官脱垂患者子宫骶韧带线粒体DNA4977缺失及其生物学意义

王晶雪 王晓庆 陆 叶

(北京大学第一医院妇产科，北京 100034)

盆腔器官脱垂(pelvic organ prolapse,POP)是中老年女性常见疾病，其发病机制尚不明确，目前已有研究仅从盆底支持结构的胶原蛋白的含量、胶原亚型的比例变化等方面探讨POP的发生机制，而对子宫骶韧带细胞基因方面的研究较少[1,2]。线粒体是真核细胞中重要的细胞器之一，不仅是细胞能量提供和储存的场所，还在细胞凋亡中发挥重要作用[3]。人线粒体DNA4977(mitochondrial DNA4977，mtDNA4977)会随着年龄的增大而逐渐缺失，与机体老化相关[4]，但这些研究仅局限在心脑血管系统等[5,6]，而线粒体DNA4977缺失在盆底组织支持结构中的研究较少。由于POP也是公认的与老化相关的疾病，因此，本研究通过线粒体DNA4977缺失在盆腔器官脱垂患者子宫骶韧带中的变化，初步探讨POP发生的相关因素。

1 材料与方法

1.1 研究对象

本研究经北京大学第一医院伦理委员会审批通过[2016(1173)]。选取2016年9月～2017年4月我科因POP Ⅱ～Ⅳ期(Ⅱ期5例、Ⅲ期16例、Ⅳ期5例)行子宫切除术的患者26例为研究组，同一时期因良性非POP疾病行子宫切除术的21例患者(其中子宫腺肌症1例、子宫肌瘤11例、子宫内膜异常增生4例、宫颈病变4例、绝经后双侧卵巢囊肿1例)为对照组。近3个月内无尿道感染、阴道手术史，未服用雌激素类药物。2组年龄、体重指数(BMI)、产次(均为阴道分娩)、难产史、孕次、初产年龄、绝经年龄等方面均无显著差异(表1)。

表1 2组临床特征参数比较

注：难产史研究组包括产钳或胎吸助产5例(其中2例巨大儿)，巨大儿1例；对照组产钳助产3例(其中1例巨大儿)，巨大儿1例

1.2 主要试剂

GENMED动物硬组织线粒体DNA萃取试剂盒购于美国Genmed Scientifics公司；TransStart Top Green qPCR Super Mix试剂盒、DNA分子量Marker、Loading buffer、Gel-red核酸染料均购于北京全式金生物技术有限公司；特异性引物合成购于北京天一辉远生物公司；琼脂糖购于美国Gibco公司，并配成2%琼脂糖凝胶；TAE缓冲液购于北京雷根生物技术有限公司，并配置成1∶50 TAE液；溴酚蓝购于美国VWR。

1.3 主要仪器

超低温冰箱(美国Thermo Scientific ULT1386-3V)，PCR仪(德国Eppendorf)，Real Time PCR System 7500(美国Applied Biosystems)，凝胶成像分析系统4000MM PRO(美国柯达)，NanoDrop 2000(美国Thermo)。

1.4 标本收集及处理

手术均由同一术者完成。术前根据POP-Q评分法由术者评定有无脱垂以及脱垂程度[7]，并签署知情同意书。切除子宫后，术者从子宫标本上取子宫骶韧带与宫颈连接处外0.5 cm处的子宫骶韧带组织约0.5 cm大小，立即投入液氮保存，再转入-80 ℃超低温冰箱保存至提取DNA时。

1.5 子宫骶韧带线粒体DNA萃取

按照GENMED动物硬组织线粒体DNA萃取试剂盒操作方法，提取子宫骶韧带线粒体DNA。用NanoDrop 2000测定样品线粒体DNA纯度和浓度(OD260/OD280值1.2～1.9，DNA浓度>10 ng/μl为合格样品)。

1.6 线粒体DNA含量和线粒体DNA4977缺失检测

参照Genbank序列，根据引物设计原则设计引物序列，由北京天一辉远生物公司合成目的基因和内参基因特异性引物，见表2。

取1 μl线粒体DNA，根据实时荧光定量PCR试剂盒使用说明，在荧光定量PCR仪进行目的基因(线粒体DNA含量、线粒体DNA4977缺失)和内参基因(GAPDH)的扩增。每个孔重复3次进行荧光实时定量PCR。用2-ΔΔCT计算目标基因对内参基因的相对表达量。将PCR扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳照胶。

表2 线粒体DNA和线粒体DNA4977缺失引物序列

1.7 统计学分析

2 结果

2.1 研究组(脱垂组)和对照组(非脱垂组)患者子宫骶韧带组织线粒体DNA4977缺失和线粒体DNA总含量比较

荧光定量PCR显示研究组子宫骶韧带组织线粒体DNA4977缺失明显高于对照组，差异有统计学意义(P=0.037)。而2组子宫骶韧带组织线粒体DNA总含量无显著差异(P=0.447)，琼脂糖凝胶电泳证实荧光定量PCR产物确为线粒体DNA4977缺失(图1、表3)。

图1 脱垂组和非脱垂组PCR产物琼脂糖凝胶电泳图

2.2 POP-Q分期与子宫骶韧带组织线粒体DNA4977缺失的关系

将对照组定义为POP-Q分期的0期，比较所有患者POP-Q分期与子宫骶韧带组织线粒体DNA4977

表3 2组子宫骶韧带组织中线粒体DNA4977缺失和线粒体DNA相对含量比较(荧光定量PCR法)

缺失的关系。虽然各期患者子宫骶韧带组织中线粒体DNA4977缺失无统计学差异，但随着POP分期的升高，子宫骶韧带组织中线粒体DNA4977缺失有增加的趋势(P=0.171)(表4)。

2.3 研究组和对照组患者子宫骶韧带组织线粒体DNA4977缺失的相关性分析

研究组(脱垂组)患者子宫骶韧带组织线粒体DNA4977缺失与年龄、BMI、孕次、产次、初产年龄、绝经年龄均无明显相关性(P>0.05)(表5和图2)。对照组(非脱垂组)线粒体DNA4977缺失与年龄有明显相关性，随着年龄的增加，线粒体DNA4977缺失增多(r=0.465，P=0.034)，而与BMI、孕次、产次、初产年龄、绝经年龄无明显相关性(P>0.05)(表5和图3)。

表4 不同POP分期患者子宫骶韧带组织中线粒体DNA4977缺失的相对含量(荧光定量PCR法)

表5 研究组和对照组患者线粒体DNA4977缺失的相关性分析

图2 研究组(脱垂组)患者子宫骶韧带组织线粒体DNA4977缺失与年龄的相关性

图3 对照组(非脱垂组)患者子宫骶韧带组织线粒体DNA4977缺失与年龄的相关性

3 讨论

由于POP的发病机制并不清楚，临床尚无满意的预测和根治方法。随着年龄的增加，POP的发生率逐渐增高。Swift等[8]观察到，年龄每增加10岁，POP发生的风险增加10%。这只是从现象上证实了POP与年龄和衰老具有相关性。我们的研究着手于线粒体DNA及线粒体DNA4977缺失，从基因的角度探讨POP发生的相关因素，为预测POP和对POP的治疗提供可能的线索。

线粒体DNA4977缺失是线粒体DNA突变的一种常见且重要的类型[9]。该缺失位于线粒体DNA序列的8470nt与13 447nt之间，被认为是产生缺失的热点区域。线粒体DNA4977片段包括ATPase8、ATPase6、COIII、ND3、ND4、ND5等编码的基因。这些基因的缺失，会引起呼吸链故障和三磷酸腺苷(ATP)生成减少，干扰有氧代谢，并产生大量氧化应激，进而导致细胞和组织出现功能障碍。目前多项研究表明，线粒体DNA突变与衰老、氧化应激有关[10]。

3.1 POP患者子宫骶韧带组织中线粒体DNA4977缺失增多

本研究中，与相匹配的对照组相比，研究组(POP组)患者子宫骶韧带组织线粒体DNA4977缺失增多，且差异有统计学意义，推测骶韧带中线粒体DNA4977缺失导致骶韧带中能量供给降低，以致骶韧带功能下降，从而导致POP的发生。本研究中，随着盆腔器官脱垂的POP-Q分期的增加，子宫骶韧带组织中线粒体DNA4977缺失逐渐增多，但无统计学差异，可能是由于样本量较少。与Sun等[11]的报道一致。但是本研究中，子宫骶韧带组织线粒体DNA总拷贝数在研究组和对照组并没有明显差异，与Sun等[11]的报道有差异，与本研究样本量较少有关，需要进一步扩大样本量研究。

3.2 线粒体DNA4977缺失与年龄

本研究结果显示，对照组患者子宫骶韧带中线粒体DNA4977缺失与年龄呈正相关，年龄越大，线粒体DNA4977缺失越多，与张幼芳[12]报道一致，该研究显示，在人类骨骼肌中，不同年龄组(0～9，10～19，20～29，30～39，40～49，50～59，60～69，70～79，80～89，90～99)中线粒体DNA4977缺失比例分别为0%、0%、0.003%、0.011%、0.015%、0.033%、0.038%、0.062%、0.069%和0.091%。但本研究中研究组(脱垂组)患者线粒体DNA4977缺失与年龄却无明显相关性，而在非脱垂患者中，线粒体DNA4977缺失与年龄呈正相关，提示POP患者可能在相对年龄比较小时，已经存在较多线粒体DNA4977缺失，可能是导致POP发生的原因。本研究中虽然研究组和对照组年龄在统计学上无差异，但研究组年龄均值较对照组毕竟大了3岁多，是否由于年龄不均衡扩大了组间差异？我们认为，线粒体DNA4977缺失虽然随着年龄增加而增加，但其增加的趋势是非常缓慢的，张幼芳[12]的研究提示线粒体DNA4977缺失在50～59岁组为0.033%，60～69岁组为0.038%，此区间大约10岁仅增加0.005%，但本研究中，研究组平均61岁，对照组平均58岁，2组仅相差3岁左右，且2组间线粒体DNA4977缺失的差异非常大，故我们考虑并没有因为2组间很小的年龄差异而导致假阳性结果。

3.3 检测POP患者子宫骶韧带组织中线粒体DNA和线粒体DNA4977缺失的临床意义

研究表明外周血或组织中线粒体DNA4977缺失有可能会成为某些疾病的生物标记，可以用于相关疾病的检测。比如Lee等[13]观察到外周血线粒体DNA4977缺失与心房颤动和重构相关，提示检测外周血线粒体DNA4977缺失可能成为心律失常的生物标记物。本研究中，骶韧带线粒体DNA4977缺失在POP患者中明显升高，提示线粒体DNA4977缺失有可能会成为POP的生物标记物。对于有POP高危因素者，检测组织中线粒体DNA和线粒体DNA4977缺失情况，或许可以用于临床上预测POP的发生，及早进行有效干预，改善POP的预后。

综上所述，骶韧带线粒体DNA4977缺失在POP患者中显著增加且在POP患者中早发生，可能是导致POP的原因之一。由于本研究的样本量小，还需要进一步扩大样本量进行更深入的研究。在今后的研究中，我们还会同时测量患者血液中线粒体DNA4977缺失含量，进一步了解其生物学意义。